Получение вакцин методом генной инженерии

Недостатком данного способа являются низкая иммунологическая эффективность  защиты взрослого населения (эпидэффективность) получаемой вакциной, а также возможность  аллергических реакций на ее введение.

Предлагаемый способ позволяет  повысить иммуногенность и снизить  аллергизирующее действие вакцины.

Это достигается тем, что в способе  получения живой гриппозной вакцины, предусматривается выращивание  вируса гриппа в развивающихся куриных  эмбрионах с последующим отделением вируссодержащей аллантоисной жидкости, осветлением, стабилизацией и лиофилизацией вируса, выращивают вирус с индексом инфекционность гемагглютинин не менее 7,0, а вируссодержащую аллантоисную жидкость подвергают дополнительной очистке ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы или микрофильтрацией.

Предлагаемый способ основан на впервые установленной неизвестной  ранее закономерности увеличения иммуногенности живой гриппозной вакцины за счет повышения степени ее очистки. Этим и объясняется введение дополнительной очистки вируса. Дополнительная очистка  здесь неочевидна еще и потому, что получаемая вакцина предназначена  для интраназального применения.

Использование индекса инфекционность (гемагглютинин  позволяет стандартизовать вирусные суспензии различных штаммов  вируса гриппа с учетом содержания в них дефектных вирусных частиц (неполного вируса) (В кн. "Вирусы гриппа и грипп, М. Медицина, 1978, с.276; Barry R.D. Virology, 1961, v.14, 389; von Magnus P. Advan. virus. Res. 1954, v.2, р.59).

Как видно  из приводимых ниже примеров, использование  вируса гриппа с меньшим значением  данного индекса приводит к резкому  снижению иммуногенности вакцины. Поэтому  использованию предлагаемого способа  должно предшествовать получение исходного  вирусного материала с индексом I

7, например по Barry R. D. Virology, 1961, 14, р.389. В зависимости от рациона питания птиц продуцентов эмбрионов меняется содержание белка в аллантоисной жидкости. При высокой концентрации общего белка C_б 0,3 мг/мл вариант очистки микрофильтрацией в режиме концентрирования с последующей диафильтрацией (см. например авт.св. СССР N 1126308, 1985), невозможен, что поясняется данными табл.1.

В табл. 1 приведены  результатов очистки ВАЖ с  антигенной структурой А(НINI), А(Н3N2) и  В предлагаемым вариантом способа, а также по функциональному аналогу.

Операции  микро- и диафильтрации проводили  на плоскопараллельных фильтровальных аппаратах, укомплектованными мембранами с величиной пор 200-300

, при этом диафильтрацию проводили фосфатным буферным раствором (ФБП) рН 7,2.

Как видно  из табл. 1, при концентрации белка  в исходной ВАЖ менее 0,3 мг/мл наиболее близкий по сущности предлагаемому  изобретению способ обеспечивает приемлемую степень очистки, тогда как при  С_б

0,3 мг/мл высокая степень очистки (до содержания белка не более 0,18 мг/мл) достигается только в варианте с предшествующей диафильтрацией ВАЖ.

Наиболее  вероятно, что причинно-следственная связь внесенного изменения стадии микрофильтрации с повышением степени  очистки вируса заключается в  том, что предшествующая диафильтрация  ВАЖ предотвращает на стадии микрофильтрации (концентрирования) образование крупных  белково-полисахаридных и белково-липидных комплексов, соизмеримых с величиной  пор мембраны, которые, концентрируясь над мембраной, препятствуют выходу белка в фильтрат.

Способ поясняется следующими примерами.

П р и м  е р 1. Вакцину получают из трех партий ВАЖ штамма вируса гриппа А(Новошахтинск)3/86 (HINI), инфекционная и гемагглютинирующая активность (в дальнейшем ИА и ГА соответственно) которых указана в табл.2. В этой же таблице приведены значения индекса ИА/ГА. Например, для второй партии ВАЖ он равен: I lg ИА lg ГА 9,1-2,1 7,0.

Для освобождения от надмолекулярных образований  ВАЖ осветляют фильтрованием  через двухслойный материал следующего состава: первый слой хлопок 30% стекловолокно  УТВ 70% второй слой хлопок 70% стекловолокно  УТВ 30% как это описано в авт. св. СССР N 1632039, 1988. Характеристики осветленной  ВАЖ приведены в табл. 2. Способ осуществляют в варианте с микрофильтрацией. В связи с тем, что во всех партиях  осветленной ВАЖ С_б

0,3 мг/мл, стадию микрофильтрации выполняют в режиме диафильтрации ВАЖ с последующей микрофильтрацией (концентрирова- нием) и повторной диафильтрацией вирусного концентрата через мембраны с размером пор фильтрационных мембран 200 на всех операциях. Диафильтрацию проводят 0,01М ФБР рН 7,2 с 0,15М NaCl. Данные операции проводят при 9^оС. Диафильтрацию ВАЖ проводят под контролем абсорбциометра до максимальной степени очистки. Микрофильтрацию проводят до десятикратного уменьшения объема жидкости в режиме тангенциального потока. Повторную диафильтрацию осуществляют десятью объемами того же буферного раствора. О степени очистки целевого и промежуточного продуктов можно судить по приведенным в табл.2 значениям концентраций общего белка С_б и овальбумина С_ов.

Полученный  очищенный вирусный концентрат стабилизируют  путем разведения 1: 5,6 гидролизином, дополнительно содержащим 0,02% сывороточного  альбумина человека (САЧ), и подвергают стерилизующему фильтрованию через  предфильтр и каскад мембран с  уменьшающимся по ходу потока размером пор: 1,2; 0,8; 0,65; 0,45; 0,22 нм. В стерильный концентрат вносят протектор лиофилизации желатиноль и Д-сорбит из расчета  по 2,5 мас. каждого. Концентрат разливают  по ампулам и лиофилизируют из замороженного до -40^о С состояния в вакуум-сушильном аппарате. Технические характеристики данных серий вакцин включены в табл.2.

Полученные  серии вакцины испытывали на 150 добровольцах.

В качестве контролей  используют неочищенную живую гриппозную вакцину, полученную по авт.свид СССР N 174327, и плацебо (апирогенный физиологический  раствор). Вакцины предварительно разводят дистиллированной водой до исходного  объема. Схема иммунизации: однократное  и двукратное (с интервалов 28 дней) введение препаратов с помощью распылителя  по 0,25 мл в каждый носовой ход.

Иммуногенную  активность препаратов оценивали по уровню антигемагглютининовых антител  в РТГА, антинейраминидазных антител  в реакции ингибиции-элюции (РИЭ) и продукции секреторных IgА. Аллергизирующие  свойства препаратов оценивали по способности  индуцировать синтез антител к овальбумину  и неовальбуминовым компонентам, а  также по величине эозинфильно-лимфоцитарного индекса (табл. 2). В табл.2 и далее  приняты следующие обозначения  этих показателей качества вакцины: АГ-АТ уровень антигемагглютининовых  антител в процентах сероконверсий  у серонегативных лиц; АН-АТ уровень  антинейраминидазных антител в  процентах сероконверсий у серонегативных лиц; N_IgА процент повышения содержания секреторных IgВ у привитых; N_ов процент сероконверсий привитых к овальбумину; 
N_нов процент сероконверсий привитых к неовальбуминовым компонентам; 
ЭЛИ эозинофильно-лимфоцитарный индекс у привитых.

Значения  показателей даны по результатам  двухкратной иммунизации. Для АГ-АТ в скобках даны значения при однократной  прививке.

Как видно  из табл. 2, вакцина, полученная из ВАЖ  с I 6,1 (серия N 1), обладает низкой (по уровню неочищенной вакцины по авт.свид. N 174327) иммуногенной активностью, а именно: АГ-АТ 50% АН-АТ 30,8% В то же время вакцины  из ВАЖ с I 7,0 и I 7,4 (серии NN 2 и 3) обладают существенно большей иммуногенностью: АГ-АТ о 75 до 83,3% АН-АТ от 60 до 70,6% При  этом значения АГ-АТ превосходят контроли даже при однократной вакцинации. Такой результат является неожиданным, поскольку инфекционная активность полученных предлагаемым способом вакцин ниже, чем у неочищенной вакцины (значения ИА вакцин приведены в  табл. 2). Резкое повышение значения N_IgА на введение очищенной вакцины по сравнению с контрольной вакциной (52,9 против 28,6%) свидетельствует о более эффективном стимулировании секреторного иммунитета.

Из анализа  приведенных значений показателей  аллергенности (N_ов, N_нов, и ЭЛИ) видно, что аллергизирующая способность целевого продукта существенно снижена. Снижение аллергизирующей способности дополнительно проверено на двух группах по 5 собак, сенсибилизированных овальбумином. Контрольная вакцина (авт.свид. СССР N 174327) вызывает выраженный бронхоспазм у всех собак, тогда как вакцина серий NN 2 и 3 такого синдрома не вызывает. Анализ этого испытания по критерию Стъюдента для малой выборки свидетельствует о том, что факт снижения аллергенных свойств полученных предлагаемым способом вакцин статистически значим при р < 0,05.

П р и м  е р 2. Вакцину получают из пяти серий  ВАЖ штамма вируса гриппа В/Ленинград/45/89, Р5. ВАЖ осветляют как в примере 1. Значения ИА, ГА и ВАЖ указанных  в табл.3.

Поскольку ВАЖ 1-й серии имеет С_б 0,24

0,3, ее подвергают микрофильтрационной очистке сначала микрофильтрацией (концентрированием, а затем диафильтрацией концентрата 2-ю и 3-ю серии (общая партия ВАЖ), а также 4-ю и 5-ю серии (тоже из общей партии ВАЖ) чистят с предварительной диафильтрацией и без нее. Режимы операций стадии микрофильтрации устанавливают как в примере 1.

Полученные  серии полуфабрикатов вакцины сохраняют  исходную инфекционную активность. При  этом при десятикратной степени  концентрирования вируса по объему содержание белка в сериях 1-4 не превышает 0,2 мг/мл. Вместе с тем, серия N5, полученная без предварительной диафильтрации  ВАЖ, имеет высокое содержание белка  С_б 5,3 мг/мл и поэтому она не пригодна для приготовления вакцины.

Вирусные  концентраты серий NN 1-4 стабилизируют  и лиофилизируют как в примере 1.

П р и м  е р 3. ВАЖ из штамма вируса гриппа А/Закарпатье/17/89 (Н3N2) c ИА 9,25 lg ЭИД₅₀, ГА 2,1 (титр в РГА 1;128), I 9,25-2,1 7,15 осветляют как в примере 1. Осветленная ВАЖ имеет концентрацию общего белка 2,7 мг/мл, овальбумина 1000 мкг/мл.

Очистку и  концентрирование вируса проводят изоплотностным центрифугированием в градиенте  плотности сахарозы 30-56% в зональном  роторе при 30 тыс. об/мин в течение 2,5 ч. Далее производят фракционирование вытеснением концентрата из ротора центрифуги 60%-ной сахарозой под  контролем рефрактометра. Фракции  в зоне плотности сахарозы 35-48% объединяют и разводят 0,01М ФБР рН 7,2 с 0,15М NaCl в соотношении 1:3. Разведенный  концентрат имеет ИА 9,66 lg ЭИД₅₀ при концентрациях общего белка и овальбумина 1,8 и 9092 мг/мл соответственно.

Данный концентрат стабилизируют, стерилизуют и лиофилизируют  как в примере 1. Полученную живую  гриппозную вакцину с содержанием  овальбумина 2 мкг/мл и ИА 7,1 lg ЭИД₅₀ использовали для прививки 115 взрослых людей. Схема вакцинации описана в примере 1. Уровень сероконверсий антигемагглютиновых антител у серонегативных лиц (53 чел.) составил 83% при этом у лиц с начальным титром антител менее 1:10 (12 чел.) наблюдали 100% сероконверсий.

П р и м  е р 4. ВАЖ из штамма вируса гриппа А/Ленинград/92/89 (НINI) с ИА 9,5 lg ЭИД₅₀, ГА 2,5, I 9,5-2,5 7,0 осветляют низкоскоростным центрифугированием в течение 40 мин при 3000 об/мин.

Осветленная ВАЖ имеет концентрацию общего белка 3 мг/мл, овальбумина 1500 мкг/мл.

Очистку, концентрирование и фракционирование вируса проводят как в примере 3. Разведенный с  помощью ФБР в соотношении 1:3 вирусный концентрат имеет ИА 10,0 lg ЭИД₅₀ при концентрациях общего белка и овальбумина 1,6 и 0,03 мг/мл соответственно.

В данный концентрат добавляют 4,6 объема стабилизирующей  среды следующего состава, мас. L-аргинин 2,0; L-глютамин 1,0; L-метионин 1,5; лактоза 5,0; САЧ 0,02, среда 199 остальное.

Разведенный вирусный концентрат стерилизуют и  лиофилизируют как в примере 1. Получают живую гриппозную вакцину  с содержанием овальбумина 3 мкг/мл и ИА 7,3 lg ЭИД₅₀.

Полученной  вакциной однократно прививали 160 взрослых людей. Схема вакцинации описана  в примере 1. Уровень сероконверсий  антигемагглютининовых антител  у серонегативных лиц (63 чел.) составил 65,6% при этом у лиц с начальным  титром антител менее 1:10 (40 чел.) наблюдали 70% сероконверсий.

Использование предлагаемого способа позволяет  получить неизвестный ранее продукт  очищенную живую гриппозную вакцину. Любые известные ранее живые  вакцины, в том числе получаемая наиболее близким способом к предлагаемому (авт.свид. СССР N 1125815), были неочищенными. Степень очистки характеризуется  данными приведенных выше примеров и таблиц.

Достигнутая степень очищенности вакцины  имеет следствием: повышение ее иммуногенности; снижение аллергизирующего действия.

Повышение уровня иммуногенной активности вакцины проиллюстрировано  по сравнению с авт.св. СССР N 174327 данными примеров 1, 3, 4. По сравнению  с авт.св. СССР N 1125815 наиболее близким  по техническому решению предлагаемому  изобретению, прямого сравнения  в эксперименте не проводили, поскольку  нет разрешения органов здравоохранения  на изготовление прототипной вакцины, в том числе для сравнительных  испытаний. Тем не менее, можно заключить, что по отношению к сравниваемому  способу также достигнуто повышение  иммунологической активности, т.к. испытания  проведены на маленьких детях, которые  встретились с вирусом гриппа впервые, в связи с чем их процент  сероконверсий должен быть повышенным. Предлагаемая вакцина испытана только на взрослых людях. При этом указанный  в примерах 1, 3, 4 процент сероконверсий  от 61 до 100% значимо (при р= 0,05) не отличается от 93,2% сероконверсий, указанных в  описании прототипа способа сравнения.

Однако новую  вакцину вводят однократно, тогда  как известные живые гриппозные вакцины двукратно, что и свидетельствует  о достижении нового данного вида положительного эффекта.

Данные о  снижении аллергизирующих свойств  вакцины, обусловленные очисткой от овальбумина приведены в примере 1.

 
Формула изобретения

1. СПОСОБ  ПОЛУЧЕНИЯ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ,  включающий культивирование вируса  гриппа в развивающихся куриных  эмбрионах, отделение вируссодержащей  аллантоисной жидкости, осветление, стабилизацию и лиофилизацию  вирусного концентрата в присутствии  протектора, отличающийся тем, что  перед осветлением проводят определение  белка в аллантоисной жидкости, для осветления используют аллантоисную  жидкость с индексом инфекционная  активность/гемагглютинирующая активность 

7, перед стабилизацией дополнительно проводят очистку вируса ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы или микрофильтрацией, стабилизацию проводят путем разведения вируса в соотношении 1 5,6 гидролизином, содержащим 0,02% сывороточного альбумина человека, а лиофилизацию проводят, используя в качестве протектора желатиноль и D-сорбит, взятые по 2,5 мас. каждого.