Вирус ньюкаслской болезни

Патологоанатомические признаки 

Изменения зависят от тяжести  течения процесса и поражения  отдельных систем организма и  варьируются в широких границах.

При остром течении болезни преобладают изменения, характерные для геморрагической септицемии. В органах пищеварения отмечают кровоизлияния в выводные протоки желез железистого желудка, а также на границе железистого и мышечного желудков, в двенадцатиперстную кишку, тонкий отдел кишечника, прямую кишку. Кровоизлияния в основания слепых отростков кишок обнаружены у 100 % больных, в переднюю часть прямой кишки— у 98,2%, по выводным протокам желез желудка —у 60 %. Отмечают кровоизлияния и в фолликулы яичника.

При хроническом течении труп истощен, оперение вокруг клоаки запачкано пометом. В кишечнике находят плоские дифтероидные язвы с многочисленными петехиями. В результате воспаления стенки двенадцатиперстной кишки и других участков тонкого отдела кишечника истончены. Отмечают также катаральный фарингит, трахеит, фибринозные и некротические очаги в легких, печени.

При осложненной форме  находят воспаление воздухоносных  мешков, некротический гепатит, серозно-фибринозный  перитонит, овариосальпингит.

Гистологические изменения  проявляются в виде негнойного энцефалита, пролиферативных процессов вокруг ретикулоэндотелиальной ткани.

Диагностика  

При характерном течении  болезни постановка диагноза не представляет сложности. При вспышке болезни  на фоне пассивного или поствакцинального  иммунитета, а тем более в стационарно  неблагополучном хозяйстве поставить  диагноз бывает чрезвычайно трудно. В этих случаях тщательно изучают  эпизоотическую ситуацию, клиническую  и патологоанатомическую картину. Решающее значение имеют лабораторные исследования - выделение вируса на КЭ, его индикация и идентификация  в РГА - РТГ А, определение вирулентности  вируса на КЭ и цыплятах, а также  выявление АТ в сыворотке переболевших или вакцинированных птиц в РТГ  А (10,11).

Индикация вируса

Экспресс-методы выявления антигена вируса НБ. Через 24 ч в инфицированных культурах клеток (шт. Н) наблюдают появление многоядерных симпластов и цитоплазматических эозинофильных включений неправильной глыбчатой формы. Через 48 ч после заражения цитоплазма бывает нафарширована тельцами-включениями. В ядрах изменений не отмечалось. Разработан высокочувствительный авидин-биотиновый ИФА. В данном тесте применяют монАТ к вирусу НБ, очищенные и меченые биотином. Тест характеризуется простотой выполнения и короткими сроками (3-4 ч) получения результатов (41). Непрямой точечный вариант ИФА является быстрым, легким, специфическим методом обнаружения вируса в смывах с различных органов (42).

В организме птицы, зараженной вирусом НБ, в процессе продолжительного контакта с вирусом эритроциты теряют способность Г А (становятся инаглютинабельными). Чтобы косвенно доказать присутствие  вируса в организме, от исследуемой  птицы берут 0,04 мл крови в формалинизированую (0,1%-ную) вируссодержащую аллантоисную жидкость, вирус должен обладать высокой  агглютинирующей активностью. Если на стекле наступает гемагглютинация, это свидетельствует об отсутствии в исследуемой капле крови  вируса НБ. Учет реакции ведут через  несколько секунд. Метод применим для выявления патогенного вируса в вакцинированном стаде, так  как вакцинные штаммы лентогенной  группы инагглютинабельности эритроцитов  не вызывают.

РГА. Используют с целью ориентировочного определения присутствия вируса в исследуемом материале и для его титрования. ГА вируса входят в состав вирусной частицы (вириона) и могут содержаться в инфицированных аллантоисной и амниотической жидкостях, оболочках и органах КЭ, легких, печени, почках и селезенке погибшей птицы, в жидкой и клеточной фракциях тканевых культур. Можно брать эритроциты крови кур, морской свинки, лошади, человека и др. Разные виды вирусов и даже шт. одного и того же вируса могут отличаться друг от друга способностью агглютинировать эритроциты указанных животных. Спектр Г А служит характеристикой биологической активности вируса и штаммов. Например, большинство шт. вируса НБ не вызывает ГА эритроцитов лошади, чем отличается от вируса классической чумы птиц, который способен ГА их в высоких разведениях.

Реакция гемагглютинации (РГА) метод обнаружения и идентификации вирусов, основанный на наличии у некоторых вирусов способности избирательно агглютинировать эритроциты определенных видов животных.

Техника постановки РГА

      На плексигласовой  доске готовят двукратные возрастающие  разведения в объёме 0,5 мл исследуемого  вируссодержащего материала , начиная  с 1:10 и до 1:1280. в луночки с  разведениями добавляют равные  объёмы 1% взвеси эритроцитов кур.  Доску осторожно встряхивают  и оставляют на 30-45 мин при комнатной  температуре. Учёт результатов  проводят по трёхкрестовой системе  в зависимости от внешнего  вида осадка эритроцитов. При  гемагглютинации на «+++» осадок  имеет форму зонтика и занимает  всё дно лунки. При отсутствии  агглютинации эритроциты оседают  в центре лунки в виде компактного  диска.

   Титром вируса  называется то наибольшее его  разведение, при котором ещё наблюдается  выраженная гемагглютинация («+++»  или «++»).Количественное содержание  вируса в разведении, равном титру,  называется гемагглютинирующей  единицей (содержится в 0,5 мл соответствующего  разведения). Определение этой величины  необходимо для постановки РТГА, в которой в качестве рабочей  дозы вируса берут 4 гемагглютинирующие  единицы.   

Серологическая  идентификация

Вирусы НБ можно идентифицировать в РТГА, PH, РСК, РИФ и др.

РТГА. Основной, высокоспецифичный и простой в выполнении метод идентификации вируса НБ. Для постановки необходимо иметь эталонные специфические сыворотки к вирусу и выделенный на КЭ вирус (аллантоисная жидкость). РТГА ставят общепринятым методом в макро- и микровариантах. Идентификацию вируса считают завершенной, если эталонная специфическая сыворотка тормозит ГА-активность вируса в пределах целого илн 1/2-1/8 титра с гомологичным эталонным АГ.

Для быстрой идентификации  выделенного вируса рекомендуют  следующий метод: на предметное стекло наносят капли аллантоисной жидкости и 1%-ную суспензию куриных эритроцитов. Затем ставят пробу на нейтрализацию  ГА-активности. Для этого на предметное стекло наносят каплю той же аллантоисной жидкости, каплю эталонной специфической  сыворотки и хорошенько перемешивают. Если агглютинации эритроцитов нет, значит выделенный вирус является вирусом  НБ.

Реакция торможения гемагглютинации - метод идентификации вируса или  выявления противовирусных антител  в сыворотке крови больного, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов препаратом, содержащим вирус, в присутствии иммунной к  нему сыворотки крови.

Принцип титрования антител в РТГА 

Принцип титрования антител  в РТГА состоит в следующем: 
- готовят ряд последовательных (обычно 2-кратных) разведений исследуемой сыворотки в одинаковых объемах (чаше по 0,25 или 0,2 мл); 
- к каждому разведению добавляют такие же объемы гомологичного вируса в титре 4 ГАЕ; 
- смеси выдерживают определенное время при определенной температуре (для вируса Ньюкаслской болезни 40-60 мин при комнатной температуре); 
- ко всем смесям добавляют равные объемы 1 % суспензии отмытых эритроцитов; 
- после экспозиции оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах. 
В реакции предусматриваются контроли сыворотки, вируса и эритроцитов. 
То наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинаиию. принимается за показатель титра антител в этой сыворотке.

РСК. В диагностической практике при НБ используют редко. Предложена РСК как быстрый и дешевый метод дифференциации штаммов вируса НБ по вирулентности.

Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), те происходит связывание комплемента комплексом антиген - антитело. Если же комплекс антиген - антитело не образуется, то комплемент остается свободным. PCK проводят в две фазы 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент, 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген - антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная).

РИФ. Метод основан на применении родаминсульфохлорида для конъюгации иммунной сыворотки к вирусу с целью идентификации вирусного АГ в пораженных клетках павших и убитых птиц. Применение этого красителя наиболее приемлемо и удобно благодаря яркому оранжево-красному свечению АГ. ФИТЦ-конъюгаты (флюоресцеинизотиоцианат) менее пригодны. Для обнаружения специфического АГ применяют гомологичные РСХ-конъюгаты общепринятым методом. В большинстве случаев АГ выявляется в ядрах клеток белой крови (лимфоцитах, моноцитах, псевдоэозинофилах и эозинофилах) или пораженных клеток указанных органов в виде яркой флюоресценции оранжево-красного цвета. В контрольных препаратах, обработанных теми же гомологичными конъюгатами, подобного свечения не наблюдается, лишь в некоторых случаях выявляется точечное желто-оранжевое свечение в цитоплазме юных эозинофилов.

Реакция иммунофлюоресценции. Прямой метод иммунофлуоресценции (по Кунсу) основан на взаимодействии антител, меченных флуорохромом с антигеном, который нахо-дится на клетке, в клетке или тканях. В качестве флуорохрома часто используют флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ). Этот краситель дает зеленое свечение в ультрафеолетовых лучах, а тетраметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ) - оранжево-красное свечение. Прямой метод одноэтапный: на фиксированный мазок клеток с антигеном наносят диагностическую сыворотку с мечеными антителами, инкубируют, отмывают и учитывают свечение в люминесцентном микроскопе. Непрямой метод иммунофлуоресценции заключается в том, что антиген обрабатывают обычной диагностической сывороткой, а для обнаружения образовавшегося комплекса антиген-антитело используют антисыворотку, меченную флуорохромом. Непрямой метод позволяет обнаруживать различные комплексы антиген-антитело с помощью одной меченной антиглобулиновой сыворотки.

Установлено, что вирусный АГ в зараженных культурах клеток выявляется, начиная с 4 ч (для велогенных штаммов) и с 6 ч (для лентогенных  штаммов), до 10-12 ч свечение АГ отмечали только в цитоплазме, а через 20 ч - в цитоплазме и ядрах клеток.

РНГА. Во ВНИВИП разработана методика получения высушенных стандартных высокочувствительных и специфических эритроцитарных тест-препаратов с АТ к вирусу НБ для экспресс-диагностики. Указанный эритроцитарный диагностикум позволяет выявить вирус в экскретах органов и тканей

Реакция непрямой (пассивной) агглютинации. Для получения феномена агглютинации антиген предварительно адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат инертные частицы (латекс, целлюлоза, полистирол и др.) или клетки (эритроциты барана, 1(0)-группы крови человека). В реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) в качестве носителя используют эритроциты. Нагруженные антигеном эритроциты склеиваются в присутствии специфических антител к данному антигену и выпадают в осадок. Если нагрузить эритроциты антителами, то их можно применять для выявления антигенов.

ИФА. Методом ИФА вирусный АГ выявляют в ранние сроки после заражения до появления ЦП Д. Через 12 ч после заражения видны единичные АГ-содержащие клетки.

Иммуноферментный  анализ (ИФА). В методах иммуноферментного анализа используют иммунореагенты, меченные ферментами. Наиболее широко используется твердофазный ИФА. В качестве твердой фазы используют полистироловые или поливиниловые планшеты или шарики, на которых адсорбированы антигены или антитела. Для выявления антител известный антиген адсорбируют в лунках полистироловой пластины. Затем вносят исследуемую сыворотку, в которой хотят обнаружить антитела к данному антигену. После инкубации лунки промывают для удаления несвязавшихся белков и вносят в них антииммуноглобулиновые антитела, меченые ферментом. После инкубации и отмывания в лунки добавляют специфичный для фермента субстрат и хромоген для регистрации конечных продуктов расщепления субстрата. О наличии и количестве антител судят по изменению цвета и интенсивности окраски раствора. 

Выделение вируса

Вирус, в зависимости от его тропизма можно выделить из головного  и костного мозга, трахеи, кишечника, селезенки, легких, печени. Для исследования рекомендуется брать голову, легкие, трахею и селезенку от только что  павших или вынужденно убитых птиц. Вирус удается выделить только в  период вспышки болезни. Через 15 дн выделить его обычными методами, как  правило, не удается. Поэтому патологический материал необходимо брать в начале вспышки (в первые 3-5 дн) и направлять в лабораторию в термосе со льдом. Внутренние органы можно помещать в стерильный 50%-ный р-р глицерина  на дистиллированной воде. Смывы из трахеи и клоаки лучше консервировать на холоде или при температуре  не выше 4°С

Заражение КЭ. Эмбрионы 9-11-дн возраста заражают по 0,2 мл, не менее 10 КЭ на ка-ждый материал, в аллантоисную полость общепринятым методом и инкубируют 72 ч при 37,5°С (погибших в первые 24 ч эмбрионов не учитывают). Если через 72 ч нет погибших КЭ, то 5 из партии зараженных убивают, оставляя их при 4°С на ночь. Остальные 5 КЭ инкубируют до 120 ч и затем убивают. Аллантоисную жидкость от погибших и живых КЭ проверяют на ГА в РГА с куриными эритроцитами (1-5%-ная взвесь). Обычно велогенные штаммы вируса вызывают гибель КЭ уже через 32-60 ч после заражения, мезогенные - через 60-90, а лентогенные - через 100 ч и более. Иногда при первом пассаже не удается выделить вирус, поэтому необходимо провести не менее 3-х “слепых” пассажей. Учитывая, что в вакцинируемых стадах можно выделить и вакцинный вирус, вторым этапом исследования должно быть определение патогенности выделенного изолята. Первым ориентиром могут служить данные РГА. Обычно полевые изоляты обладают низкой ГА-активностью, проявляя ее в разведениях 1:16- 1:128, тогда как вакцинные штаммы, наоборот, проявляют высокий ГА-титр - 1:256 - 1:2048.