Биосенсоры

По типу биологического распознающего элемента биосенсоры классифицируют на:

1. каталитические. Группа каталитических биосенсоров основана на ферментах, срезах тканей и клетках микроорганизмов. Их основная особенность состоит в расходовании анализируемого соединения в биохимических реакциях его трансформации по схеме: "внесение пробы – взаимодействие субстрата с ферментом – образование продукта ферментативной реакции".
2. К группе аффинных относятся биосенсоры на основе антител/антигенов, лектинов, рецепторов животных клеток, нуклеиновых кислот. Их особенностью являются процессы высокоспецифического связывания анализируемого соединения (но не его трансформации и расходования) с мишенью, содержащейся в распознающем элементе биосенсора. Важно отметить, что многие исследователи отдельно выделяют группу гибридных биосенсоров, в которых сопряжены элементы аффинного взаимодействия и ферментного усиления сигнала.

 

 

 

1.4 Особенности биосенсорного анализа

Основными качествами биосенсорного  анализа, принципиально отличающими  его от классических вариантов физико-химических методов анализа, являются:

безреагентность – для выполнения анализа, как правило, не требуется производить добавление к исследуемому образцу каких-либо химических соединений, реагентов;

простота анализа – отсутствует  необходимость привлечения к  его выполнению высококвалифицированного персонала;

низкая стоимость одиночного анализа, обусловленная простотой аппаратурной реализации;

высокая чувствительность и специфичность – обусловлена применением биологического материала, осуществляющего превращения некоторых веществ, изменяющего свои свойства в присутствии биологически активных соединений или образующего с анализируемым соединением легко идентифицируемые комплексы;

многократность – возможность  многоразового определения заданного  вещества;

возможность использования в полевых  или домашних условиях.

Примеры биосенсора

Самый известный пример коммерческого  биосенсора — это биосенсор для  измерения уровня глюкозы в крови, в котором используется фермент  глюкозоксидаза для расщепления содержащейся в крови глюкозы. В процессе расщепления фермент сначала окисляет глюкозу и использует два электрона для восстановления ФАД (компонент фермента) в ФАДН2, который, в свою очередь, окисляется в несколько ступеней электродом. Результирующий ток пропорционален концентрации глюкозы. В этом случае, электрод является преобразователем, а фермент — биоселективным элементом.

С недавних пор, массивы из многих различных молекул детектора  применяются в так называемых электронных носах, где наборы откликов от детекторов используются для определения  веществ. Современные электронные  носы, тем не менее, не используют биологический  материал (то есть являются хемосенсорами).

Домашняя канарейка, которая применялась  шахтерами для предупреждения об утечке газа, может считаться биосенсором. Многие из современных биосенсоров  работают на том же принципе, то есть используют организмы, которые реагируют  на значительно меньшие концентрации токсических веществ, чем это  делает человек, предупреждая таким образом о присутствии яда. Эти приборы могут использоваться для экологического мониторинга, определения незначительных примесей нефтепродуктов и на сооружениях для очистки сточных вод.

 

 

Биосенсоры могут  быть использованы для:

– измерения пищевой ценности, свежести и безопасности продуктов  питания;

– экспресс-анализа крови непосредственно  у кровати больного;

– обнаружения и измерения степени  загрязнения окружающей среды;

– детекции и определения количества взрывчатых веществ, токсинов и возможного биологического оружия.

1.5. История развития биосенсоров

Автором не только биосенсорной концепции, но и первого биосенсора является американский профессор Леланд Кларк (Leland C. Clark Jr.). В 1956 г. Л. Кларк опубликовал свою основополагающую работу, посвященную аналитическому применению изобретенного им кислородного электрода, который в дальнейшем стали называть электродом Кларка. Назначением электрода Кларка являлось измерение концентрации (содержания) кислорода в жидких и газовых средах.

 В 1962 г. Л. Кларк выступил на собрании Нью-Йоркской Академии Наук, где, делясь собственным опытом, а также выражая мечты и планы на будущее, связанные с возможностью анализа состава биологических жидкостей, он представил сообщение о том, как сделать существующие в то время электрохимические сенсоры (рН, полярографические, потенциометрические или кондуктометрические электроды) более "умными", сопрягая их с ферментами. Эту концепцию он проиллюстрировал экспериментом, в котором глюкозоксидаза (ГОД) была иммобилизована на кислородном электроде.

В 2010 году мировой рынок биосенсоров  составил более 13 миллиардов долларов США, причем около девяти десятых  от этого обеспечивается приборами  для измерения концентрации глюкозы.

1.6. Способы подачи проб при измерениях

Для того, чтобы с помощью биосенсора произвести оценку концентрации вещества в пробе, необходимо ввести пробу в среду, в которой находится распознающий элемент. Существуют два основных типа измерения веществ с помощью биосенсоров – кюветный и проточный (проточно-инжекционный вариант). В кюветном способе измерения сенсор погружен в кювету (измерительную ячейку), содержащую перемешиваемый раствор буфера; анализируемая проба вводится в измерительную кювету (рисунок 4).

Рисунок 4. Устройство биосенсора кюветного  типа на основе кислородного электрода  с биоматериалом каталитического  типа.

При этом происходит, как правило, значительное разведение пробы, которое  определяется отношением объема кюветы к объему пробы. Это приводит к  увеличению нижней границы определяемых содержаний. Особенностью кюветного  способа измерения является также  то, что введение пробы при интенсивном  перемешивании раствора приводит к  быстрому установлению стационарного  уровня концентрации вещества в объеме кюветы, который сохраняется в  течение всего периода измерения.

В проточно-инжекционном варианте измерения  биосенсор встроен в канал, по которому постоянно прокачивается  раствор буфера (рисунок 5).

Рисунок 5. Устройство биосенсора проточно-инжекционного  типа на основе кислородного электрода  с биоматериалом каталитического  типа.

Проба инжектируется (впрыскивается) в поток буфера и через определенное время поступает в зону измерительного электрода. Время контакта пробы  с электродом определяется скоростью  потока, объемом пробы и объемом  приэлектродной камеры. В отличие от кюветного варианта, концентрация вещества в пробе не изменяется, поскольку не происходит ее разбавления, и некоторое время электрод находится в непосредственном контакте с неразбавленной пробой. В этом случае нижняя граница определяемых содержаний может быть смещена в область более низких концентраций по сравнению с аналогичным параметром при кюветном способе измерения.

1.7.Типы регистрации ответа биосенсора

 В качестве измеряемого параметра  биосенсора могут быть использованы: начальная скорость развития  сигнала (кинетический метод)  или величина амплитуды сигнала  (равновесный метод). Преимущество  использования начальной скорости  в качестве параметра состоит  в возможности сокращения времени  измерения пробы. Так, в случае, когда диффузионные процессы  в рецепторном элементе замедлены  в силу ряда причин (значительная  толщина мембраны-носителя, содержащего  иммобилизованный биоматериал, применение  микробных клеток в качестве  измерительного элемента и т.д.), для регистрации сигнала достаточным  является измерение начальной  скорости изменения сигнала. После  того, как начальная скорость зарегистрирована, измерительная кювета промывается свежим раствором буфера. Через определенное время восстанавливается исходное значение выходного сигнала сенсора, что является критерием готовности сенсора к следующему циклу измерений. Измерение амплитуды сигнала используют в том случае, когда сигнал биосенсора имеет высокий уровень шумов. В таких случаях измерение амплитуды позволяет снизить случайную ошибку и повысить точность анализа.

1.8.Основные параметры биосенсоров

Эффективность биосенсора, как и  любого аналитического прибора, определяется его характеристиками. К основным характеристикам биосенсора относятся: диапазон определяемых содержаний, коэффициент  чувствительности, селективность, экспрессность и долговременная стабильность2. Большинство из этих понятий подробно

исследований существуют некоторые  специфические устоявшиеся термины  и понятия.

Важнейшей характеристикой биосенсора является его диапазон определяемых содержаний или рабочий диапазон. Важно отметить, что биосенсоры аффинного  типа, как правило, позволяют анализировать  намного более низкие концентрации веществ (от 10-12 до 10-6 моль/дм3), чем биосенсоры каталитического типа (от 10-6 до 10-3 моль/дм3) .

Еще одним важным преимуществом  аффинных биосенсоров над каталитическими является их абсолютная селективность, то есть возможность определения анализируемого компонента независимо от других компонентов пробы. Большинство каталитических биосенсоров, в особенности микробных, являются неселективными, и могут быть использованы для анализа узкого набора проб.

Уникальной характеристикой биосенсоров, неприсущей химическим сенсорам, является долговременная стабильность. Долговременная стабильность характеризует устойчивость работы сенсора в течение длительного  периода времени и является характеристикой  самого рецепторного элемента. Она  зависит от природы биомассы и  от способа его иммобилизации. В  большинстве случаев аффинные сенсоры  предназначены для одноразового использования, а каталитические биосенсоры могут устойчиво функционировать  до нескольких месяцев.

СЕНСОРЫ НА ОСНОВЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

 В последние годы разработано  множество биосенсоров для определения  органических соединений. Многие  ферментные сенсоры обладают  высокой специфичностью по отношению  к представляющим интерес субстратам, однако используемые в них  ферменты дороги и неустойчивы.  Микробные сенсоры состоят из  иммобилизированных микроорганизмов и какого-либо электрохимического датчика и пригодны для непрерывного контроля биохимических процессов. Принцип работы микробных сенсоров - это ассимиляция органических соединений микроорганизмами, что регистрируется электрохимическими датчиками.

СЕНСОР  ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСВАИВАЕМЫХ  САХАРОВ

 При культивации микроорганизмов  на патоке сахарного тростника,  содержащей различные сахара, для  контроля процесса брожения важно  определение суммарного содержания  усваиваемых Сахаров в среде.  Так, при высокой концентрации  сахара наблюдается подавление  катаболизма, что приводит к  подавлению роста клеток. Восстановленные  сахара и сахарозу в культуральных средах можно определять феррицианидным методом. Этот метод, однако, не вполне надежен, поскольку неусваиваемые сахара могут мешать определению.

Усвоение органических соединений микроорганизмами можно оценивать  по дыхательной активности последних, которую в свою очередь можно  непосредственно измерить при помощи кислородного электрода.

Для непрерывного определения общего содержания усваиваемых Сахаров (глюкозы, фруктозы и сахарозы) в бродильной среде сконструирован микробный  сенсор, состоящий из иммобилизованных живых клеток. Общее содержание усваиваемых  Сахаров оценивали по потреблению  кислорода иммобилизованными микроорганизмами. Добавление аликвотной части глюкозы  приводило к увеличению поглощения кислорода в растворе. В результате электродный ток постепенно понижался, пока не достигал некоторого стационарного  значения. Время отклика сенсора  составляло 10 мин при измерении  стационарного тока и 1 мин в импульсном режиме. Существует линейная зависимость  между уменьшением тока и концентрацией  глюкозы (до 1 мМ), фруктозы (до 1 мМ) и сахарозы (до 0,8 мМ) соответственно. Чувствительность микробного сенсора к этим сахарам оценивается соотношением 1,00: 0,80: 0,92. При использовании растворов, содержащих 0,8 мМ глюкозы, относительное стандартное отклонение для величины уменьшения тока составляло 2%. Общее содержание усваиваемых Сахаров рассчитывали, суммируя значения аналитических сигналов для откликов на глюкозу, фруктозу и сахарозу, при этом разность истинных и расчетных концентраций не превышала 8%. Микробный сенсор помещали в бродильную среду для получения глутаминовой кислоты, где он надежно работал более 10 дней и выдержал 960 измерений.

ГЛЮКОЗНЫЙ СЕНСОР

Для определения глюкозы предложен  микробный сенсор, состоящий из иммобилизованных целых клеток Pseudomonas fluorescens и кислородного электрода. Сенсор помещали в исследуемый раствор, который во время измерений насыщали кислородом и перемешивали магнитной мешалкой.

 

На рис.2.4 показана типичная зависимость  сигнала сенсора от времени. При 30"С стационарный ток устанавливался в пределах 10 мин. Точное время отклика зависело от концентрации добавленной глюкозы. При удалении микробного сенсора из раствора и помещении в среду, не содержащую глюкозы, ток постепенно возрастал и возвращался к начальному уровню примерно за 15 мин при 30°С.

Сенсор проявляет слабую чувствительность к фруктозе, галактозе, манозе, сахарозе и не чувствителен к аминокислотам. Поэтому избирательность определения глюкозы при помощи этого микробного сенсора можно считать вполне удовлетворительной. При измерениях стационарного тока зависимость между током и концентрацией глюкозы линейна до концентрации 20 мг/л, причем нижняя граница определяемых концентраций глюкозы составляла 2 мг/л. При содержании глюкозы 10 мг/л значение тока воспроизводилось с точностью +6%. Стандартное отклонение составило 6,5 мг/л при числе опытов более 20.