История открытия лектинов

 

 

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Саратовский государственный аграрный университет имени Н. И. Вавилова»

 

 

История наук

 

 

 

 

 

 

 

РЕФЕРАТ

 

 

на тему: «История открытия лектинов»

 

 

 

Выполнил аспирант 1 года обучения:

 Тяпкин Александр Юрьевич

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Карпунина Лидия Владимировна

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Саратов 2015

 

Содержание

ВВЕДЕНИЕ         3

1. Открытие лектинов        4

2. Бактериальные лектины       7

3. Функции лектинов                                                                      16

4. Заключение                             19 

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ   20

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

В последнее время все большее внимание исследователи уделяют изучению углеводсвязывающих белков-агглютининов. Это связано с тем, что лектины присутствуют в любой биологической системе, в любом живом организме на разных уровнях организации. Они участвуют в процессах углевод - белкового узнавания, обладают широким спектром действия и находят применение в различных областях биологии и в медицине.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Открытие лектинов

Первый лектин был открыт доктором Германом Петером Штильмарком (1860-1923) в Дерптском университете. Дерптский университет занимал почетное место в иерархии университетов Российской империи конца прошлого века. В нем работали и учились многие видные деятели науки и культуры России, Эстонии и Германии. В то время работа мало кому известного медика, представленная к защите на соискание ученой степени доктора медицины, прошла незаметно. Молодой соискатель в 1888 году представил к защите диссертацию "Ueber Ricin, ein giftiges Ferment aus den Samen von Ricinus comm. L. und einigen anderen Euphorbiaceen", выполненную в Институте фармакологии университета, посвященную вопросу использования природы токсичности семян клещевины. Клещевина известна как растение семейства молочайных, как правило, однолетнее (на юге двух- и трехлетнее), из семян которого добывают касторовое масло. В лечебном деле это масло является сильным слабительным, а в технике использовалось в двигателях в качестве смазывающего масла, слабо загустевающего при низких температурах. Семена клещевины и неочищенное масло очень токсичны для человека, что и привлекло внимание фармакологов Дерптского университета.

 Штильмарк Г.П. был не первым, кто изучал в Институте фармакологии Дерптского университета токсины семян клещевины, но ему впервые удалось выделить высаливанием белок из токсичного экстракта семян клещевины, исследовать его и дать ему название "рицин" по названию клещевины ricinus communis. В лаборатории его шефа и директора института Рудольфа Коберта (1852-1922) проводились исследования влияния различных токсинов на организмы животных, их кровь и эритроциты. Г. Штильмарк обнаружил способность токсинов вызывать агглютинацию эритроцитов, то есть способность индуцировать гемагглютинацию. Таким образом, рицин - это первый из открытых лектинов, относящихся к группе растительных лектинов или фитогемагглютининов. Надо отметить важный вклад в первые шаги молодой науки лектинологии доктора Рудольфа Коберта. Именно благодаря его энергии и целеустремленности проводили исследования и других природных фитогемагглютининов. Достаточно сказать, что за несколько лет были получены и даже переданы известной химической фирме "Merck" для выпуска такие фитогемагглютинины, как рицин и абрин, по технологии Г. Штильмарка. Пионерские работы эстонских ученых в области лектинологии на десятилетия определили интересы многих ученых к природе этих веществ и их способности к агглютинации эритроцитов. Последнее свойство привело к открытию еще одного важного свойства некоторых растительных лектинов. Они являются митогенами, то есть веществами, влияющими на циклы клеточного деления. Это очень важное качество фитогемагглютининов используется в экспериментальной биологии, генетике, цитологии и онкологии. Для этой цели они в основном сейчас производятся и продаются различными фирмами. Лектин под названием "фитогемагглютинин (ФГА)" характеризует все растительные лектины, и в экспериментальной биологии это название закрепилось за лектином, выделенным из семян фасоли обыкновенной phaseolus vulgaris. Итак, рицин открыл список растительных лектинов. Сейчас этот список очень велик: это и рицин, и абрин, и ФГА, это и КонА - конконавалин - лектин из конского боба сanavalia ensiformis, WGA (wheat germ agglutinine) - агглютинин из проростков семян пшеницы и многие другие. Следует сказать, что сам термин "лектин" у фитогемагглютининов появился очень недавно. Ввел его в обиход выдающийся иммунолог У. Бойд в 60-х годах нашего столетия, использовав для этого латинское слово "legere" (выбирать). Этим он как бы подчеркивал способность фитогемагглютининов избирательно связываться с теми или иными углеводными рецепторами клеток. Сейчас, как уже упоминалось выше, лектины выделены и охарактеризованы практически из всех живых организмов от вирусов до человека. Стало даже более или менее ясно, что эти белки служат организму путем влияния на углеводные рецепторы как чужеродных, так и своих клеток или субклеточных структур. Естественно поэтому, хотя бы в общих чертах, разобраться с этими рецепторами, расположенными на поверхности клеточных мембран и клеточных стенок.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Бактериальные лектины

Первые сведения о гемагглютининах бактерий появились в 1902 году. A. Kraus и J. Ludwig [1] обнаружили агглютинацию кроличьих эритроцитов культурами и фильтратами некоторых видов стафилоккоков и Vibrio. Выявленные гемагглютинины, которые оказались термолабильными, разрушались при нагревании до 58-60°С в течение 30 минут.

Позднее перечень бактерий, проявляющих гемагглютинирующую  активность, очень быстро пополнялся. Работы этого периода чаще всего носят описательный характер и посвящены обнаружению все новых видов и штаммов бактерий, в основном энтеропатогенных, способных агглютинировать эритроциты различных млекопитающих и человека. Появились первые сообщения об обнаружении гемагглютинина у кишечной палочки, тесно связанного с бактериальной клеткой и отсутствующего в супернатантах и фильтратах культур [2]. Убитые формалином бактерии не теряли гемагглютинирующей активности. Большинство изученных штаммов Escseririchia coli агглютинировали эритроциты различных животных [3]. Некоторые бактериальные токсины (например, токсины Е. сoli, стафилококков, бацилл) агглютинировали не только эритроциты, но и лейкоциты, тромбоциты, сперматозоиды различных животных [4-6].

После обнаружения гемагглютинации в фильтратах культуры Clostridium botulinum Lowental с сотрудниками [7, 8] сделали предположение, что отвечает за эту активность ботулинический токсин. Токсин имеет белковую природу и состоит из мономера молекулярной массой 53 kDa и тримера с молекулярной массой 160 kDa. Он включает две субъединицы пo 13 и одну 27 kDa, ковалентно связанные между собой двумя S-S мостиками. Kamata с соавторами предположили, что токсин С. botulinum прикрепляется к поверхности эукариотических клеток в основном за счет сиалоспецифичности, и это прикрепление зависит от заряда связывания и достигается неспецифическим гидрофобно (фосфолипид) - гидрофильным (токсин) взаимодействием. Гемагглютинирующая активность была обнаружена и у энтеротоксина     C. perfringens. Энтеротоксин представлял собой полипептид с молекулярной массой 34 kDa. Углеводная специфичность токсина не была определена ни с одним из использованных для этой цели моно-, ди-, полисахаридов, гликопротеинов и ганглиозидов. Авторы предположили, что рецепторы энтеротоксина С. perfringens на эритроцитах кролика имеют белковую природу.

Интенсивно проводимые в последние годы исследования молекулярных основ патогенности бактерий убедительно доказали, что первой ступенью инфекционного процесса является специфическая адгезия бактериальных клеток к клеткам различных тканей хозяина. Показано, что прикрепление некоторых бактерий к животным клеткам специфично ингибируется маннозой. Затем было обнаружено, что и другие сахара также могут ингибировать прикрепление различных бактерий к клеткам-хозяевам. Однако из-за широкого распространения маннозоспецифичной адгезии среди грамотрицательных бактерий их стали разделять на маннозоспецифичные и маннозорезистентные бактерии. Адгезия последней группы ингибировалась различными сахарами, среди них фукоза, галактоза, N - ацетилглюкозамин, сиаловая кислота. P. Echdat с сотрудниками высказали предположение, что именно лектиноподобные молекулы на поверхности бактерий медиировали их прикрепление к остаткам маннозы, локализованным на эпителиальных клетках. 

Позже было установлено, что бактериальные поверхностные лектины могут присутствовать в различной форме, чаще всего в виде пилей (называемых также фимбриями). Участие пилей в маннозоспецифической адгезии Е.соli к клеточным поверхностям доказано четкой корреляцией между присутствием пилей и маннозоспецифической гемагглютинацией, проявляемой бактериями . Эти пили, обозначенные как “пили типа 1” состояли из одинаковых белковых субъединиц (молекулярная масса 17 kDa), известных как “пилин”. Выделенные и очищенные пили агглютинировали эритроциты морской свинки. Реакция специфически ингибировалась маннозой или её производными. Таким образом, исследователи соотносили наличие фимбрий с адгезивными свойствами бактериальных клеток. Однако это было справедливо для пяти из шести различаемых типов фимбрий. Только фимбрии типа 2, обнаруженные у некоторых видов сальмонелл и являющиеся, вероятно, мутантными формами фимбрии типа 1, не являлись адгезинами.

Электронная микроскопия бактериальных клеток некоторых штаммов Serratia marcescens и Е.соli, которую провел P. Echdat с соавторами, неожиданно показала практически полное отсутствие пилей на поверхности и значительное количество жгутиков. Жгутики разных видов бактерий различались по молекулярной структуре их белковых субъединиц. Встряхивание бактерий в Омнимиксере приводило к удалению жгутиков и потере агглютинирующей активности.

Как в последствии оказалось, помимо адгезинов, встречающихся в виде пилей, жгутиков, маннозоспецифичные лектины могут также быть прочно связанными с внешней мембраной бактерий. Так, целый ряд штаммов Е.соli, электронно-микроскопическое исследование которых показало отсутствие пилей и жгутиков, агглютинировали дрожжевые клетки. Внешние мембраны бактерий при их изолировании также вызывали специфическую агглютинацию дрожжевых клеток. Возникло предположение, что агглютинин клеточной стенки представляет собой либо фимбриальный мономер, включенный во внешнюю мембрану без полимеризации, либо лектин клеточной стенки являясь белком, отличным от пилина, содержит сходный маннозосвязывающий сайт.

Таким образом, литературные данные показывают, что маннозоспецифичные лектины бактерий могут быть локализованы как в пилях и жгутиках, так и на внешней поверхности клеточной стенки, проявляя одинаковую специфичность связывания. Подобная локализация указывает на двухстадийность адгезии бактериальных клеток к клеткам-мишеням - сначала дистанционное взаимодействие посредством пилей, а затем контактное взаимодействие с помощью клеточной стенки, что приводит к окончательной адгезии.

Лектиноподобный белок в составе мембраны, медиирующий прикрепление, имеет микоплазма. В процесс прикрепления этих бактерий на поверхности животных клеток включено узнавание углеводных структур. Это делает микоплазмы превосходной моделью для изучения бактериальных лектинов. Тесное взаимодействие (ассоциация) микоплазм с эукариотическими клетками хорошо изучено с использованием электронной микроскопии. Оказалось, что специализированные электронно-плотные структуры на концах многих клеток микоплазм функционируют как органеллы, обеспечивающие полярное или "концевое" прикрепление. Сканирующая электронная микроскопия показала, что некоторые формы Мусоbасtеriа рпеитоniae могут также прикрепляться к эритроцитам посредством мембранных сайтов, отличных от концевых структур. J. Goswani с соавторами впервые дали характеристику внеклеточного маннан - специфичного лектина                         М. stegmatis. Его молекулярная масса оказалась 12-kDa. По всей вероятности, лектин обеспечивал адгезивную способность микобактерий, что являлось первым шагом инфекционного процесса микобактерий на макрофагах.

Группой исследователей во главе с O. Haataji (1996) был идентифицирован адгезин из культуры клеток Streptococcus suis. Очищенный, 18-kDa адгезии адсорбировался частицами латекса и вызывал гемагглютинацию, которая ингибировалась N-ацетилгалактозамином или галактозой. По сведениям P. Denson с соавторами, клеточная суспензия   S. sorbinus агрегирует с -1,6 глюканом, образуя высокомолекулярные кластеры. Эта способность определяется присутствием глюкансвязывающего лектина (GBL), находящегося на поверхности клеток. Авторы отводят этому лектину определяющую роль в прикреплении S. sorbinus к дентальным поверхностям. Лектиновая активность GBL уменьшалась при воздействии анионного детергента додецилсульфат натрия (SDS), однако предварительная инкубация лектина с -1,6 глюканом защищала лектин от денатурации. По всей видимости, этот углевод стабилизировал лектин           S. sorbinus.

Как и у многих других патогенных бактерий лектин был обнаружен у холерного вибриона. Холерный лектин, выделенный из классического биовара Inaba обладал гемагглютинирующей активностью и способностью ингибировать адгезию холерных вибрионов к клеткам кишечного эпителия кролика. Лектин представлял собой белок с молекулярной массой 32 kDа. Было выделено три изоформы этого белка с изоэлектрическими точками 6.3, 5.3, 4.7. Удивительной особенностью белка является то, что все три изоформы обладают протеолитической активностью. Белок не образует фимбриальных структур на поверхности клетки и отличается хорошей растворимостью. Холерный лектин продуциривали все штаммы холерного вибриона. Хотя до сих пор нет фактических данных о специфическом рецепторе на эукариотических клетках для адгезии холерного вибриона, опыты по ингибированию этого процесса некоторыми моносахаридами свидетельствуют в пользу того, что данный рецептор имеет гликопротеиновую природу.

Из рода Streptomyces было выделено довольно большое число лектинов. Японские исследователи описали обнаружение свободной и связанной формы лектинов стрептомицетов. Так, лектин свободного типа, выделенный в среду культивирования, в отличие от лектина связанного типа (прикрепленного к клеточной стенке), специфичный к фукозе и маннозе, впервые был обнаружен у штамма Streptomyces Sр N16-3 (SFL 16-3) [9]. Выделение SFL 16-3 проводили с помощью аффинной хроматографии при использовании в качестве лиганда L-фукозы. Изоэлектрическая точка        SFL 16-3 была равна 5.2, для аминокислотного состава было характерно отсутствие цистеина и малое содержание метионина. Молекулярная масса, рассчитанная по данным гель-электрофореза с SDS, была равна 70 kDa.

У группы бактерий Bacteroides fragilis были обнаружены лектинопо- добные адгезины с использованием иммобилизованных сахаров на агарозе. Были идентифицированы два углевода - D-глюкозамин и                    D- галактозамин, которые связывались с целыми клетками. Среди восьми тестированных штаммов B.fragilis два показывали наибольшую адгезивность. Лектин был очищен аффинной хроматографией и в              SDS-форезе показал одну полосу 70 kDa. Смесь суспензии B.fragilis и S.faecalis агрегировала на иммобилизованном на агарозе глюкозамине. Прединкубация клеток Е.coli с очищенным лектином приводила к агрегации на иммобилизованном глюкозамине.