Гематологические характеристики рыб при биоиндикации

Тромбоциты выполняют ряд важнейших функций. Одна из них участие в процессе гемостаза. В тромбоцитах помимо многочисленных ферментов и биологически активных соединений, присутствуют вещества, называемые тромбоцитарными факторами, участвующие в свертывании крови. В настоящее время известно более 11 факторов, регулирующие процессы адгезии (прилипание к поверхности) тромбоцитов, их агрегации (склеивание), связывание гепарина, уплотнение кровяного сгустка, сужение сосудов и пр.

Кроме участия в гемостазе, тромбоциты выполняют функцию транспорта креаторных веществ, важных для сохранения структуры сосудистой стенки. Они  поглощаются клетками эндотелия, доставляя  им находящиеся в тромбоцитах макромолекулы. На эти цели ежедневно расходуется до 15% циркулирующих в крови тромбоцитов. При нарушении указанного процесса эндотелий сосудов подвергается дистрофии и начинает пропускать через себя эритроциты.

Помимо этого, тромбоциты способны фиксировать антитела и выполняют фагоцитарную функцию. Доказаны и иммуногенные свойства тромбоцитов.

 

 

1.2 Взятие крови

 

Кровь берут  у голодной рыбы, выдержанной в  хорошо аэрированной воде в течение 5-10 минут после отлова. Если это невозможно, то пойманную рыбу следует сразу помещать в ведро с водой из водоема в соотношении 1:10, содержащей релаксирующую концентрацию одного из анестетиков: пропаксат (0,6 - 0,8 мг/л), хиналдин (25 - 30 мг/л), серный эфир (1 - 1,5 %) и др. Вода, в которой находится анестезированная рыба, должна постоянно аэрироваться.

В зависимости  от размера объекта и необходимого количества крови кровь берут несколькими способами: из сердца, жаберной вены, хвостовой артерии, отсечением хвоста.

Место пункции  после снятия чешуи обрабатывают 70° спиртом и высушивают ватным тампоном для удаления слизи. Для взятия крови чаще используют шприц с инъекционной иглой либо пастеровскую пипетку. Инструменты предварительно обрабатывают водным раствором антикоагулянтов: цитрата натрия или гепарина. Место взятия крови нельзя сжимать во избежание попадания тканевой жидкости, искажающей результаты. Повторно брать кровь из одного и того же места не рекомендуется. Анализируемая кровь должна быть свежей, жидкой.

Во избежание  разрушения эритроцитов (гемолиза) кровь берут в подготовленные пробирки (или часовое стекло), сливая осторожно по стенке.

 

1.3 Приготовление и  окраска мазков крови

 

Кровь после  взятия (см. п. 1.2) наносят в виде небольшой капли на заранее приготовленное обезжиренное предметное стекло, на расстоянии 1,5-2 см от его шлифованного края. Большим и указательным пальцами правой руки берут шлифованное стекло за боковые ребра, ставят на предметное стекло под углом 45° и подвигают тыльной стороной к капле, которая от соприкосновения растекается. Скользящим движением продвигают шлифованное стекло вперед. Кровь должна равномерно распределяться по предметному стеклу в виде мазка.

От каждой рыбы готовят не менее двух мазков. После  приготовления мазка его высушивают на воздухе в течение 10-15 минут.

Подсохшие мазки без фиксации окрашивают по Паппенгейму (Романовскому - Гимза). Первый этап - окрашивание и фиксация и одновременно раствором Май-Грюнвальда в течение 5 минут, затем промывают нейтральной дистиллированной водой.     Второй этап - докрашивание в рабочем растворе Романовского 30-40 минут. Качество окраски клеток контролируют под малым увеличением микроскопа. Окрашенные мазки промывают водопроводной водой и высушивают на воздухе.

 

1.4 Оценка эритроцитарной  картины крови рыб

 

По соотношению  молодых и зрелых форм эритроцитов оценивают активность эритропоэза. Соотношение эритроцитов выражают в процентах (%).

Под микроскопом  на мазке крови просматривают  не менее 1000 эритроцитов при увеличении х 630 (под иммерсией). Клетки идентифицируют, используя "Атлас клеток крови рыб" (Иванова, 1983) и выводят процент различных стадий созревания эритроцитов по формуле:   Х = (А * 100) /1000 = А * 0,1 %, где: А - число незрелых эритроцитов, встречающихся при подсчете 1000 эритроцитов;

Х - искомый процент  незрелых эритроцитов.

Незрелые эритроциты:

Эритробласт - клетки с крупным ядром, содержащим ядрышки (рис. 2.1). Вокруг ядер располагается слой базофильной цитоплазмы. Процентное содержание данной группы в красной крови незначительно - 0,04%.

Базофильный нормобласт - клетка округлой формы с большим, плотным, занимающим ²/₃ клетки ядром и интенсивно окрашивающейся базофильной цитоплазмой. Вокруг ядра узкий ободок светлой перинуклеарной зоны (рис. 1.1).

Полихроматофильный нормобласт - клетка с относительно широким слоем цитоплазмы, резко очерченным ядром и пренуклеарным пространством (рис. 1.2).

Оксифильный нормобласт - клетка округлой формы с плотным красно-фиолетовым ядром и оранжевой цитоплазмой. Наибольшая группа среди молодых эритроцитов (2,25%) (рис. 1.3).

Зрелые эритроциты - самая многочисленная среди красной крови группа клеток (рис. 1.4).

 

 

Рис. 2. Эритроцитарная картина крови: 1-эритробласт; 2-базофильный нормобласт; 3-полихроматофильный нормобласт; 4-оксифильный нормобласт; 5-зрелый эритроцит

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

Нарастающие масштабы загрязнения водоемов различными техногенными соединениями являются причиной поиска критериев в оценке их состояния. Особое место в потоке поступающих в водные экосистемы аллохтонных веществ занимают органические соединения, которые наряду с автохтонным органическим веществом, образующимся непосредственно в водоеме, определяют уровень эвтрофирования водных экосистем и оказывают существенное влияние на органолептические свойства воды. Изменения, происходящие в гидросфере, наиболее сильное воздействие оказывают на водные организмы, в том числе рыбы, которые чутко реагируют на изменения состояния среды и именно их целесообразнее использовать в качестве биоиндикаторов.

Рыбы, как завершающее звено в трофической  цепи водоемов являются объективными индикаторами уровня загрязнения водной среды в целом.  Наиболее консервативными и пригодными для биомониторинга являются бентосные организмы.

Среди комплекса биоиндикационных методов важное место занимают гематологические исследования, основывающиеся на использовании показателей состава крови. В данной работе рассмотрен процесса взятия крови рыбы и приготовления мазка для гематологических исследований.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

 

1. Житенева Л.Д. Атлас нормальных и патологически измененных клеток крови рыб. Житенева Л.Д., Полтавцева Т.Г., Рудницкая О.А.- Ростов-на-Дону: Кн. изд-во, 1989.-112 с.- ISBN 5-7509-1273-6.
2. Иванова Н.Т. Атлас клеток крови рыб (сравнительная морфология и классификация форменных элементов крови рыб). /М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983.- 184 с.
3. Методические указания по гематологическому обследованию рыб в водной токсикологии. / Сост. Крылов О.Н.-Л.: Изд-во ГосНИОРХ, 1974.- 40.с.
4. Немоза Н.Н., Высоцкая Р.У. Биохимическая индикация состояния рыб. М.: Наука. 2004. 316 с.
5. Справочник по физиологии рыб./ Сост. А.А. Яржомбек, В.В. Лиманский, Т.В. Щербина с соавт. Под.ред. А.А. Яржомбека.-М.: Агропромиздат, 1986.- 192 с.
6. Эколого-гематологические характеристики некоторых видов рыб. Справочник. /Сост. Л.Д. Житенева, О.А. Рудницкая, Т.И. Калюжная. – Ростов-на-Дону:  Изд-во «Молот», 1997. – 152с.- ISBN 5-86524-023-4.
7. Кудрявцев А.А. Гематология животных и рыб / А.А. Кудрявцев, Л.А.Кудрявцева, Т.И.Привольнев - М.: Колос, 1969. - 320 с.