Исследование токсичности наноматериалов

водную среду, наночастицы взаимодействуют  с различными веществами, находящимися в воде, Это могут как природные  вещества, например гуминовые кислоты, так находящиеся в воде экотоксиканты. Показано, что наличие в воде наночастиц может усиливать действие опасныхэкостоксикантов (Zhangetal., 2007). Например, аккумуляция Cd²⁺ в тканях карпа из водь: возрастала до 146% в присутствии наночастиц (ТЮг).

Имеющихся на сегодняшний день сведений об экотоксичностинаноматериалов для  рыб мало, однако уже сейчас понятно, что инженерныенаноматериалы могут  быть потенциальнс опасны. Поэтому  необходимы систематические исследования не только на организменном уровне но также на уровне популяций и  сообществ. Они должны включать в  себя изучение не толькс токсичности наночастиц, но иих поведение в экосистемах, в том числе перенос по трофическим сетям, биомодификацию, биодеградацию и оценку действия на разные экологические группы рыб.

3.1.2 Использование флуоресценции хлорофилла для оценки токсического действия наноматериалов на природный фитопланктон[по: 3]

Материалы нанотехнологии уже сегодня  получили широкое применение в технике  v медицине. Увеличение производства приведет к увеличению их выброса в окружающую среду Наночастицы и наноматериалы обладают комплексом физических, химических свойств i биологическим действием, которые часто радикально отличаются от свойств этого же вещества i форме сплошных фаз или макроскопических дисперсий. Поэтому, чрезвычайно важным являете? оценка экологических последствий их влияния на экосистемы.

Применение флуоресценции водорослей в качестве биосенсоров может  быть с успехом использовано для  тестирования наноматериалов (Маторин  и др.2010а). Однако на природном фитопланктоне  эти работы не проводились. Между  тем фитопланктон - базовое звено  биоценозов которое определяет состояние  и продуктивность водных экосистем. При действии антропогенны? загрязнений  изменяется фотосинтетическая активность клеток фитопланктона (Antaletal., 2001 2009, 2011).

Регистрация фотосинтетической активности микроводорослей позволяет определит! состояние основных первичных продуцентов  пищевой цепи и, поэтому, являете* чувствительнейшим  сенсором, характеризующем здоровье водной экосистемы. Перспективно использовать методы измерения флуоресценции  хлорофила, позволяющие проводить  мониторинг фитопланктона прямо  в природной среде (Маторин и  др.2010 б). В настоящей работе с  использованием флуоресценции хлорофилла исследовано экотоксикологическое влияние на природный планктон разныхнаночастиц.

Материалы и методы исследования. Опыты проводили с природным  фитопланктоном из прибрежных вод Белого моря. Водоросли экспонировались  в условиях близким к природным. В работе исследованы синтезированный  нанокомпозит, алмазные наночастицы (размер 10 нм), препарат наносеребра [Ag] (средний радиус 40 нм), препарат коллоидного золота [Аи\ (средний радиус 25 нм).

Флуоресценцию измеряли на импульсном портативном флуорометре, разработанном  на кафедре биофизики МГУ (Погосян  и др.2009). У водорослей, адаптированных к темноте, регистрировали максимальный квантовый выход фотосистемы 2 (ФС 2) Fv/Fm, где Fv=Fm-Fo. Измерения на свету проводили при последовательном увеличении интенсивности от 0 до 800 мкЕ/(м² с). В конце каждого сеанса освещения с использованием насыщающей вспышки (0,8 с, 3000 мкЕ/(м² с)), регистрировались параметры Fm¹, а также выход флуоресценции на свету F(t) (Маторин и др.2010 б). На основании всех параметров рассчитывали - нефотохимическое тушение флуоресценции NPQ=(Fm-Fm')/ Fm', квантовый выход фотохимического превращения поглощенной световой энергии в фотосистеме 2 как отношение Y= (Fm'-Ft)/Fm' и относительную скорость нециклического электронного транспорта при данной интенсивности света rETR= Y х Е;, х 0,5, где Ei - освещенность, (мкЕ/м² с). Использована общепринятая номенклатура (Schreiberetal., 1994).

Результаты исследований. С использованием флуоресценции показано влияние  разных наночастиц на природный фитопланктон Белого моря (Табл). Наблюдали снижение максимального квантового выхода ФС 2- Fv/Fm, скорости нециклического электронного транспорта у фитопланктона под влиянием наночастиц серебра, золота, алмаза, нанокомпозита Рез04/НА_тесь,. Особенно значительное ингибирование фотосинтеза водорослей наблюдалось при воздействии коллоидного раствора, содержащего наночастицы серебра в рекомендованном для медицины препарате «Аргоника». Эффект отмечался при концентрациях даже 10' М, что сравнимо с действием высокотоксичного метилртути. Наночастицы золота мало изменяли фотосинтетическую активность фитопланктона даже в высоких концентрациях. Параметр нефотохимического тушения флуоресценции (NPQ), связанный с энергизацией мембран, также уменьшался при действии исследованных, наночастиц. Только наночастицы золота увеличивали этот параметр

Таблица. Изменения параметров флуоресценции - Fv/Fm - проб в темноте, rETR_max - максимальная относительная скорость электронов по электрон транспортной цепи и NPQ=(Fm/F'm)-l - нефотохимическое тушение флуоресценции при 800 мкЕ/(м с) у природного фитопланктона.

Параметры флуоресценции	Контроль	Нано золото [Аи] 10-4 М	Алмазные наночастицы(0,01%)	Нано- серебро 10-5 М	Коллоидное серебро в препарате  «Аргоника». 10-7 М.	НанокомпозитFe304/HAmech (0,005%)
Fv/Fm	100%	97%	46,2%	76%	37%	69%
ETR (max.).	100%	83%	23%	43%	19%	48%
NPQ	100%	129%	23%	53%	29%	55%

Таким образом, проведенные исследования указывают на возможность использования  этих флуоресцентных характеристик  фитопланктона для экспрессного обнаружения в природной водной среде наноматериалов в достаточно низких концентрациях и проводить  диагностику на ранних стадиях воздействия  наноматериалов на фитопланктон до появления  видимых нарушений в водных экосистемах, что может позволить вовремя  осуществить природоохранные мероприятия. Следует отметить, что в настоящее время в РФ имеется сертифицированная высокочувствительная флуоресцентная аппаратура (импульсный флуорометр «МЕГА-25) для биоиндикащш воздействия наноматериалов на фитопланктон в режиме реального времени. Модификация этого аппарата уже опробована в автономном режиме на природном фитопланктоне непосредственно в ереде его обитания в работах вблизи скважин и прокладываемых нефтепроводов.

3.1.3 Влияние наночастиц металлов на выживаемость 
и плодовитость ceriodaphniaaffinis [по: 4]

Развитие нанотехнологий ведет  к появлению множества материалов, содержащих наноразмерные частицы. В настоящее время объем промышленного производства наночастиц составляет сотни тысяч тонн, они применяются повсеместно - от лакокрасочной до пищевой 
промышленности. Наиболее «популярными» являются углеродные частицы(нанотрубки,фуллерены, графен), наночастицы оксида кремния, золота, серебра, оксида цинка и диоксида титана.

Вещества в наноразмерном состоянии  приобретают новые свойства и становятся биологически активными. Это, с одной стороны, открывает возможности использования наноматериалов в области биомедицины, фармакологии,производстве продуктов питания, прирешении экологических и сельско-хозяйственных проблем. С другой стороны, высокая 
биологическая активность наночастиц несет в себе риски токсических эффектов. Несмотря на это,ни один вид наноматериалов не изучен в достаточном объеме с точки зрения безопасности и 
данные об их токсичности неоднозначны. В ходе экспериментальных работ показано,что наличие в среде метало оксидных наночастиц приводит к физиологическим изменениям и нарушениям поведения водных беспозвоночных и не оказывает токсического действия на рыб (Крысанов и др.,2010). Данные по генотоксичности, тератогенности, эмбриотоксичности, мутагенности наночастиц, а также влиянии на гормональный и иммунный статус живых организмов литературных источниках практически отсутствуют (Колесниченко и др., 2008, Baunetal., 2008).

Поскольку вещество в виде наночастиц обладает свойствами, часто радикально отличными от их микро- и макроскопических аналогов, наноматериалы представляют собой принципиально новый фактор, воздействующий на организм. Поэтому оценка возможного влияния таких 
материалов на окружающую среду и живые организмы в связи с этим представляется актуальной(Онищенко, 2007). Все это определяет необходимость изучения действия веществ в виде 
наночастиц на компоненты водной экосистемы, в том числе и с помощью биологических тест-объектов (Крысанов и др., 2010).

Цель работы - оценить влияние  наночастиц оксидов (ТЮг, СеОг и ZnO) и благородных (Аи, Ag) металлов на выживаемость и воспроизводство ветвистоусых ракообразныхCeriodaphniaaffinisLillijeborg (1862) (Cladocera, Crustacea).

Исследование токсичности наночастиц металлов для цериодафний проводили., с использованием стандартной методики (Mount, Norberg, 1984). Критерием острого токсического действия для рачков служила гибель > 50 % особей за 48 ч в исследуемых растворах, хронического - гибель > 20% животных и достоверное отклонение плодовитости от контрольных значений за 7 сут. Суспензию наночастиц металлов непосредственно перед опытом вносили в отстоянную артезианскую воду, концентрации получали путем последовательного разведения маточных растворов. Для снижения слипания частиц растворы перемешивали в течение 2-3 мин на ультразвуковомдиспергаторе УЗДН-2Т (Томилина и др., 2011). Для стабилизации наночастиц серебра и золота использовали поливинилпирролидон и тиолят соответственно. Характеристика исследованныхнаночастиц представлена в табл. 1.

 

Таблица 1. Характеристика исследованныхнаночастиц

Наночастицы	Фрма частиц	Размер, нм	Диапазон исследованных концентраций, мг/л
Диоксид титана	цилиндрическая	10-50	0.2-200
Диоксид церия	треугольная или ромбическая	10-100	0.2-200
Оксид цинка	шестиугольная, булавовидная, веретенообразная и цилиндрическая	15-350	0.02-200
Золото	сферическая	5-6	0.0001-1
Серебро	сферическая, эллипсоидальная или  неправильная	5-85	0.005-0.000002

Результаты обрабатывали статистически, используя метод дисперсионного анализа (ANOVA) и процедуру LSD-теста при уровне значимостир=0.05 (Sokal, Rohlfj 1995). Статистический анализ результатов проводили с помощью пакета программ STATGRAPHICSPlus 2.1.

Острое токсическое действие за 48-час экспозиции отмечено для оксида цинка в концентрациях 2, 20 и 200 мг/л  и диоксида титана - 200 мг/л. Достоверное  снижение выживаемости цериодафний  за 7 суток отмечено в растворах  оксида цинка в концентрации 0.1 - 0.15 мг/л, диоксида титана - во всем исследуемом  диапазоне концентраций, диоксида церия - 0.2 и 20 мг/л (рис. 1). Концентрационная зависимость  гибели цериодафний достоверна только в остром опыте (г= 0.73,/?= 0.007) для диоксида титана.

 

 

Рис. 1. Выживаемость цериодафний за 7 сут в растворах наночастиц оксидов  металлов по оси ординат - концентрация, мг/л, по оси абсцисс - выживаемость, % контроля [по: 4]

 

Среднее число пометов, достоверно ниже контрольных значений, зарегистрировано для всех исследованных веществ  и концентраций, за исключением диоксида титана 2 мг/л и оксида цинка - 0.05 мг/л. Среднее количество молоди на 1 самку - достоверно ниже во всех растворах. Исключение - ZnO в концентрации 0.05 мг/л). Сокращение количества молоди происходило за счет увеличения длительности созревания эмбрионов, а не уменьшения их числа в помете. Установлены достоверные корреляционные зависимости репродуктивных показателей и концентраций исследованных веществ: ZnO (г= -0.37, р- 0.0001), ТЮг (г= -0.59, р= 0.000), Се0₂ <г= -0.45, р= 0.0001).

Снижение плодовитости цериодафний отмечено при их содержании как в высоких, так и низких концентрациях металлооксидныхнаночастиц (о чем свидетельствует линия тренда плодовитости рачков на рис. 2) .

 

 

 

 

 

Рис. 2. Плодовитость цериодафний за 7 сут в растворах металлококсидныхнаночастицпо оси ординат - концентрация, мг/л, по оси абсцисс - среднее число молоди на 1 самку, %контроля [по: 4]

Острое токсическое действие за 48-час экспозиции отмечено для наночастиц серебра в концентрациях 0.1, 0.05 и 0.01 мг/л. Для золота в исследованном диапазоне концентраций острая токсичность не зарегистрирована.

Среднее количество молоди на 1 самку, достоверно ниже контрольных значений, зарегистрировано для наночастиц серебра и золота во всех исследованных концентрациях, за исключением 0.0001 мг/л золота (рис. 3). Установлены достоверные корреляционные зависимости репродуктивных показателей и концентраций благородных металлов: Ag (г= -0.61,/?= 0.0001), Аи (г= 0.56,0.0001).

 

 

 

 

 

Рис. 3. Плодовитость цериодафний за 7 сут в растворах наночастиц благородных металлов. По оси ординат - концентрация, мг/л, по оси абсцисс - среднее число молоди на 1 самку, % отконтроля [по: 4]

Имеющиеся данные по токсичности металлооксидныхнаночастиц  для пресноводных гидробионтов противоречивы, возможно, потому, что не всегда при  планировании и проведении экспериментов  помимо концентрации частиц вещества учитывались их размеры, форма и  другие параметры. Большинство оценок токсичности наноматериалов для  гидробионтов проведено в острых тестах, что не позволяет оценить хронические эффекты и отдаленные последствия их воздействия, которые могут оказаться значительными, особенно для животных с продолжительным жизненным циклом. Информация о накоплении наночастиц в различных органах и тканях животных и их миграции по пищевым сетям фактически отсутствует. Биотесты на ракообразныхDaphniamagna, D. pulex, Ceriodaphniaaffinis могут оказаться перспективными для изучения токсичности и влияния наночастиц на поведение, размножение, появление морфологических аномалий, а также накопления и локализации в организме животных при длительном воздействии, учитывая, что они наиболее стандартизированы из всех используемых (Baunetal., 2008).