Фотохимические превращения ДНК. Люминесцентные метки и зонды и их применение в биологии и медицине

АО «Медицинский Университет Астаны»

Кафедра

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СРС на тему:

Фотохимические превращения ДНК. Люминесцентные метки и зонды и их применение в биологии и медицине.

 

 

 

 

 

Выполнила:  Аймакова А.С

136 гр-ОМ

Проверила: Маслякова Е.П

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Астана 2014гг.

 
ПЛАН: 
 
1. Введение. 
2.Стадии фотохимической реакции. 
3. Типы фотохимических реакций. 
4. Люминесцентная микроскопия. 
5. Люминесцентные метки и зонды и их применение в медицине. 
Литература. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Введение 
      
Чтобы раскрыть суть темы, для начала хочу объяснить, что такое ФОТОХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ? Фотохимические реакции -это химические реакции, происходящие под воздействием света; имеют важнейшее общебиологическое значение. По характеру биологического эффекта фотохимические реакции подразделяют на физиологические и повреждающие. К физиологическим относятся те реакции, которые лежат в основе фотосинтеза, биосинтеза физиологически важных веществ -витаминов,   пигментов     и др., а также реакции обеспечивающие физиологические функции связанные с получением информации из окружающей среды, - зрение, тропизмы, таксисы. Повреждающие фотохимической реакции имеют в своей основе действие света, особенно УФ-излучения, на нуклеиновые кислоты и белки. В результате может наблюдаться гибель клеток. 
 1. Стадии фотохимической реакции. Всякую фотохимическую реакцию можно разделить на три стадии: 
     - акт поглощения фотона, при котором появляются 
      электронно-возбужденные атомы или молекулы; 
     - первичные фотохимические процессы, в которых участвуют эти 
      электронно-возбужденные частицы; 
      - вторичные (темновые) превращения самого различного 
      характера.

 Количественной  мерой эффективности фотохимической  реакции служит квантовый выход, представляющий собой отношение  числа прореагировавших молекул  к числу инактивация ферментов и др.

 
 
ПЕРВИЧНЫЕ ФОТОХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ БЕЛКОВ. 
 
 
В настоящее время доказано, что основной первичной фото-реакции триптофана (АН) в белке является его фотоионозация с образованием катион-радикала и сольватированого электрона. 
При комнатной температуре эта реакция протекает за 5-20 мкс и исследована с использованием метода флеш-фотолиза. Показано, что через 5 мкс после Уф облучения в растворе триптофана появляются характерные спектры поглощения в красной и дальней красной области спектра, которые принадлежат выбитому сольватированному электрону, т.е. Электрону, «выбитому» из молекулы аминокислоты и захваченному дипольными молекулами растворителями. Сольватированный электрон быстро реагирует с другими молекулами, в частности, с молекулами растворителя и, вследствие чего полоса его поглощения исчезает. Однако, если облучать замороженные образцы триптофана при температуре жидкого азота ( в этих условиях сольватированные электроны не рекомбинируют), то поглощение сольватированого электрона (максимум при 600 нм) можно зарегистрировать и на обычном спектрофотометре. Кроме того, наличие некомпенсированного магнитного момента (спин) у сольватированного электрона позволяет обнаружить его методом ЭПР. 
 
2. ФОТОХИМИЧЕСКИЕ ПРЕВРАЩЕНИЕ ДНК. 
 
Согласно общепринятому мнению, ДНК основная внутриклеточная мишень при летальном и мутагенном действии коротковолнового УФ излучения. Это в частности, подтверждается совпадением максимума в спектрах действия фотобиологических эффектов (260-265 нм) с максимумом в спектре поглощения ДНК. Основными хромофорами ДНК являются азотистые основания нуклеотидов, причем квантовые выходы фотопревращений пирими-диновых компонентов примерно на порядок выше, чем пуриновых. Поглощение азотистыми основаниями квантов Уф света ( максимум поглощения при 260 нм) приводит к образованию их электронно-возбужденных синглетных и триплетных состояний, которые возникают за счет (–(*-переходов. Электронно-возбужденные состояния пиримидиновых оснований могут вступать в ряд фотохимических реакций, из которых, биологически наиболее важны три реакции присоединения: димеризация, гидратация и образования сшивок с белком. 

Реакция фотодимеризации. 
 
Эта реакция впервые была обнаружена при Уф облучении замороженных растворов тимина. Она состоит в соединении двух оснований по 5,6-двойной углеродной связи с образованием кольца циклобутанового типа. 
Характерная черта реакции димеризации ее обратимость. Пиримидиновые основания поглощают свет в области 200-300 нм, их димеры примерно в том же диапазоне УФ-спектра (200-285 нм).Поэтому при Уф облучении оснований или ДНК для каждой длины волны возбуждающего света между димерами и основаниями устанавливается динамическое равновесие, определяемое соотношением поперечных сечений димеризации оснований и мономеризации димеров. Так, в случае облучения тимина при 200 нм димеризуется около 65% оснований, а при 280-15%. 
 
Вследствие бимолекулярного характера реакций фотодимеризации ее квантовый выход существенно зависит от степени взаимоориентации мономеров при возбуждении одного из них. Например, квантовый выход димеризации тимина в водном растворе при комнатной температуре - 4,7(10-4, а в замороженном - 1. Квантовый выход димеризации тимина в ДНК - 2(10-2. В соответствии с проведенными расчетами условия для димеризации тимина в ДНК являются оптимальными, если соседние мономеры ориентированы друг к другу под углом в 36 . 
Некоторые красители акридинового ряда могут эффективно уменьшать выход УФ- индуцированных димеров в ДНК. Защитное свойство акридинов основано на их способности интеркалировать между парами оснований в молекуле ДНК. Характерная черта взаимодействия акридинов (например акридиновый оранжевый) с ДНК заключается в том, что при образовании комплекса резко увеличивается интенсивность флуоресценции красителя в максимуме спектра при 530 нм. По мнению некоторых авторов, это может быть обусловлено синглет-синглетной миграцией энергии возбуждения с оснований на краситель. Расчеты показывают, что максимальный квантовый выход такой миграции энергии достигается при соотношении 1 молекула красителя / 5 оснований и составляет 32%. 
Помимо увеличения интенсивности флуоресценции тестом на связывание акридинов с ДНК может служить так же изменение степени поляризации люминесценции, зависящей от подвижности молекул красителей. С

Помощью этого метода показано, в частности, что плоскость кольца акридинового оранжевого перпендикулярна длинной оси спирали ДНК и параллельна плоскостям оснований. 
 
Реакция фотогидратации. 
Этот процесс - вторая важная фотохимическая реакция пиримидиновых оснований ДНК, которая заключается в присоединении воды к пиримиддиновым основаниям ДНК, которая заключается в присоединении воды к пиримидиновому кольцу у С 5(Н) и С6(ОН) углеродных атомов с разрывом двойной связи между ними и образованием 6-окси-5-гидропроизводных оснований. 
В отличие от димеризации реакция гидратации не является фотообратимой. Однако гидраты могут разрушаться при повышении температуры (>30 50 0С) и ионной силы раствора, а так же при сдвигах рн. Скорость фотогидратации уменьшается при замене Н2О на Д2О. Предшественниками гидратов пиримидинов являются видимо, их синглетные возбужденные состояния. В пользу этого свидетельствуют следующие данные: триплетные тушители не влияют на фотогидратацию, квантовый выход реакции не зависит от длины Уф света, хотя вероятность конверсии в триплетное состояние зависит от нее, избирательное фотосенсибилизированное заселение триплетных уровней оснований не приводит к их гидратации. Особенность реакции фотогидратации заключается в том, что она протекает только в одно-цепочной ДНК. Поэтому гидраты пиримидинов могут вносить вклад в летальный или мутагенный эффект лишь у клеток с активным процессом репликации и транскрипции, в ходе которых появляются короткие одно-цепочные участки ДНК. 
 
Люминесце́нция (от лат. Lumen, род. Падеж luminis — свет и -escent — суффикс, означающий слабое действие) — нетепловое свечение вещества, происходящее после поглощения им энергии возбуждения. Впервые люминесценция была описана в XVIII веке. Типы люминесценции[править | править исходный текст] 
 
Люминесцентное свечение тел принято делить на следующие виды: 
 
• Фотолюминесценция — свечение под действием света (видимого и УФ-диапазона). Она, в свою очередь, делится на 
• флуоресценцию (время жизни 10−9−10−6 с); 
• фосфоресценцию (10−3−10 с); 
• Хемилюминесценция — свечение, использующее энергию химических реакций; 
• Катодолюминесценция —

Вызвана облучением быстрыми электронами (катодными лучами); 
• Сонолюминесценция — люминесценция, вызванная звуком высокой частоты; 
• Радиолюминесценция — при возбуждении вещества ионизирующим излучением; 
• Триболюминесценция — люминесценция, возникающая при растирании, раздавливании или раскалывании люминофоров. Триболюминесценция вызывается электрическим разрядами, происходящими между образовавшимися наэлектризованными частями — свет разряда вызывает фотолюминесценцию люминофора. 
• Биолюминесценция - способность живых организмов светиться, достигаемая самостоятельно или с помощью симбионтов. 
• Электролюминесценция- возникает при пропускании электрического тока через определённые типы люминофоров. 
• Кандолюминесценция — калильное свечение. 
• Термолюминесценция — люминесцентное свечение, возникающее в процессе нагревания вещества. В научной литературе часто используется термин Термостимулированная люминесценция, сокращенно ТСЛ, что одно и то же. 
В настоящее время наиболее изучена фотолюминесценция. 
У твёрдых тел различают три вида люминесценции: 
• мономолекулярная люминесценция — акты возбуждения и испускания света происходят в пределах одного атома или молекулы; 
• метастабильная люминесценция — акты возбуждения и испускания света происходят в пределах одного атома или молекулы, но с участием метастабильного состояния; 
• рекомбинационная люминесценция — акты возбуждения и испускания света происходят в разных местах. 
Методы исследования 
Для изучения люминесценции широко применяются методы спектрофотометрии. На них основано не только измерение спектров люминесценции, но и определение выхода люминесценции. Для исследования люминесценции большое значение имеет измерение релаксационных характеристик, например затухания люминесценции. Для измерения коротких времен затухания порядка 10-8-10-9 сек, характерных для спонтанной люминесценции при разрешенных переходах, применяются флуорометры, а также различные импульсные методы. Изучение релаксации более длительной люминесценции например люминесценции кристаллофосфоров производится при помощи фосфороскопов и тауметров. 
 
Применение люминесценции

 
Кроме названных выше способов применения не

Следует забывать о повседневном использовании явления люминесценции. На рекламные стенды, стоящие вдоль дорог, наносятся люминофоры, на многих предприятиях, знаки на стенах и полу покрыты люминофорами, для того чтобы, люди при эвакуации могли легко ориентироваться в темноте. 
Люминесцентный анализ [37] позволяет по характеру люминесценции обнаруживать различие между предметами, кажущимися одинаковыми. Он применяется для диагностики заболеваний (например, ткань, пораженную микроспорумом, обнаруживают по яркой зелёной люминесценции её под действием ультрафиолетового света), для определения поражённости семян и растений болезнями, определения содержания органических веществ в почве и т.п. С помощью люминесценции производят анализ горных пород для обнаружения нефти и газов, изучают состав нефти, минералов, горных пород и т.д. Люминесцировать могут самые разные минералы [38]. Среди них и драгоценные камни [39] - алмаз, рубин, сапфир, топаз, шпинель, кунцит, опал, лазурит, бирюза, янтарь, но есть и "простые" минералы. Вот короткие описания люминесценции некоторых распространенных минералов (указаны: название минерала, его химическая формула, цвета люминесценции в КВ и ДВ диапазонах): 
Алмаз. C. КВ и ДВ: голубой, светло-зеленый, желтый, оранжевый, красный. 
Арагонит. Ca[CO3]. КВ и ДВ: белый, зеленый, желтый, кремовый, голубовато-белый, красный. Оранжевый. 
Апатит. Ca5[(F,Cl,OH)|(PO4)3]. КВ и ДВ: оранжевый, желтый. Коричневы, красный, кремовый, белый, фиолетовый, голубовато-серый. 
Кальцит. Ca[CO3]. КВ и ДВ: красный, белый. Зеленый. Голубой, оранжевый, фиолетовый, пурпурный. 
Корунд (рубин, сапфир). Al2O3. КВ и ДВ: красный, пурпурный, оранжевый, желтый; КВ: голубой.

 

Литература:

- Рубин А. Б. Биофизика (учебник) в 2-х т.т. — М., 1999, 2002.

-  Владимиров Ю., Рощупкин Д. И., Потапенко А. Я., Деев А. И. Биофизика; Медицина - Москва, 1983. - 272 c. 
-  Рубин, А.Б. Биофизика. Биофизика клеточных процессов; М.: Университет; Издание 2-е, испр. и доп. - Москва, 2000. - 468 c.