Оптическая система глаза. Микроскопия. Специальные приемы микроскопии

в) Поляризационная микроскопия позволяет изучать объекты исследования в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях, т.е. в поляризованном свете. Для этого используют пленчатые поляроиды или призмы Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. Поляризация меняется при прохождении (или отражении) лучей света через различные структурные компоненты клеток и тканей, свойства которых неоднородны. В так называемых изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, в анизотропных структурах скорость его распространения меняется в зависимости от направления света по продольной или поперечной оси объекта. Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях — отрицательное двойное лучепреломление. Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, являются анизотропными и обладают положительным двойным преломлением света. Такими свойствами обладают миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, нейрофибриллы, коллагеновые волокна и др. Сопоставление характера преломления лучей поляризованного света и величины анизотропии объекта позволяет судить о молекулярной организации его структуры. Поляризационная микроскопия является одним из гистологических методов исследования способом микробиологической диагностики (Микробиологическая диагностика), находит применение в цитологических исследованиях (Цитологическое исследование) и др. При этом в поляризованном свете можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные и нефиксированные, так называемые нативные препараты срезов тканей.

г) Люминесцентная микроскопия основана на свойстве некоторых веществ давать свечение — люминесценцию в УФ-лучах или в сине-фиолетовой части спектра. Многие биологические вещества, такие как простые белки, коферменты, некоторые витамины и лекарственные средства, обладают собственной (первичной) люминесценцией. Другие вещества начинают светиться только при добавлении к ним специальных красителей — флюорохромов (вторичная люминесценция). Флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивают отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта. На этом основано использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях. С помощью иммунофлюоресценции в люминесцентном микроскопе выявляют вирусные антигены и их концентрацию в клетках, идентифицируют вирусы, определяют антигены и антитела, гормоны, различные продукты метаболизма. В связи с этим люминесцентную микроскопию применяют в лабораторной диагностике таких инфекций, как герпес, эпидемический паротит, вирусный гепатит, грипп, используют в экспресс-диагностике респираторных вирусных инфекций, исследуя отпечатки со слизистой оболочки носа больных, и при дифференциальной диагностике различных инфекций. В патоморфологии с помощью люминесцентной микроскопии распознают злокачественные опухоли в гистологических и цитологических препаратах, определяют участки ишемии мышцы сердца при ранних сроках инфаркта миокарда, выявляют амилоид в биоптатах тканей.

д) Ультрафиолетовая микроскопия основана на способности некоторых веществ, входящих в состав живых клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных, прозрачных в видимом свете тканей, поглощать УФ-излучение с определенной длиной волн (400—250 нм). Этим свойством обладают высокомолекулярные соединения, такие как нуклеиновые кислоты, белки, ароматические кислоты (тирозин, триптофан, метилалании), пуриновые и пирамидиновые основания и др. С помощью ультрафиолетовой микроскопии уточняют локализацию и количество указанных веществ, а в случае исследования живых объектов — их изменения в процессе жизнедеятельности.

е) Инфракрасная микроскопия позволяет исследовать непрозрачные для видимого света и УФ-излучения объекты путем поглощения их структурами света с длиной волны 750—1200 нм. Для инфракрасной микроскопии не требуется предварительной химической обработки препаратов. Этот вид М.м.и. наиболее часто используют в зоологии, антропологии, других отраслях биологии. В медицине инфракрасную микроскопию применяют в основном в нейроморфологии и офтальмологии.

ж) Стереоскопическая микроскопия используется для исследования объемных объектов. Конструкция стереоскопических микроскопов позволяет видеть объект исследования правым и левым глазом под разными углами. Исследуют непрозрачные объекты при относительно небольшом увеличении (до 120 раз). Стереоскопическая микроскопия находит применение в микрохирургии, в патоморфологии при специальном изучении биопсийного, операционного и секционного материала, в судебно-медицинских лабораторных исследованиях.

2.2. Электронная  микроскопия

Для изучения на субклеточном и макромолекулярном уровнях структуры клеток, тканей микроорганизмов и вирусов используют электронную микроскопию. Этот М.м.и. позволил перейти на качественно новый уровень изучения материи. Он нашел широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, генетике, иммунологии. Резкое повышение разрешающей способности электронного микроскопа обеспечивается потоком электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами. Электроны могут проходить через структуры исследуемого объекта (трансмиссионная электронная микроскопия) или отражаться от них (сканирующая электронная микроскопия), отклоняясь под разными углами, в результате чего возникает изображение на люминесцентном экране микроскопа. При трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии получают плоскостное изображение структур, при сканирующей — объемное. Сочетание электронной микроскопии с другими методами, например с радиоавтографией, гистохимическими, иммунологическими методами исследования (Иммунологические методы исследования), позволяет проводить электронно-радиоавтографические, электронно-гистохимические, электронно-иммунологические исследования.

 Электронная микроскопия  требует специальной подготовки  объектов исследования, в частности  химической или физической фиксации  тканей и микроорганизмов. Биопсийный  материал и секционный материал  после фиксации обезвоживают, заливают  в эпоксидные смолы, режут стеклянными  или алмазными ножами на специальных  ультратомах, позволяющих получать ультратонкие срезы тканей толщиной 30—50 нм. Их контрастируют и затем изучают в электронном микроскопе. В сканирующем (растровом) электронном микроскопе изучают поверхность различных объектов, напыляя на них в вакуумной камере электронно-плотные вещества, и исследуют так называемые реплики, повторяющие контуры образца. 

2.3. Рентгеновская  микроскопия.

Рентгеновская микроскопия – совокупность методов исследования микроскопического строения объектов с помощью рентгеновского излучения. В рентгеновской микроскопии используют специальные приборы — рентгеновские микроскопы. Их предел разрешения может быть на 2—3 порядка выше, чем световых, поскольку длина волны λ рентгеновского излучения на 2—3 порядка меньше длины волны видимого света.

Специфичность взаимодействия рентгеновских лучей с веществом обусловливает отличие рентгеновских оптических систем от оптических систем для световых волн и для электронов. Малое отклонение показателя преломления рентгеновских лучей от единицы (меньше чем на 10-4) практически не позволяет использовать для их фокусировки линзы и призмы. Электрические и магнитные линзы для этой цели также неприменимы, так как рентгеновские лучи инертны к электрическому и магнитному полям. Поэтому для фокусировки рентгеновских лучей используют явление их полного внешнего отражения изогнутыми зеркальными плоскостями или отражение от кристаллографических изогнутых плоскостей (отражательная рентгеновская микроскопия). Благодаря высокой проникающей способности, простоте линейчатой структуры спектра и резкой зависимости коэффициента поглощения рентгеновского излучения от атомного номера элемента рентгеновскую микроскопию можно осуществить по методу проекции в расходящемся пучке лучей, испускаемых «точечным» источником (проекционная, или теневая рентгеновская микроскопия).

         Отражательный рентгеновский микроскоп  содержит микрофокусный источник  рентгеновского излучения, изогнутые  зеркала-отражатели из стекла (кварца  с нанесённым на него слоем  золота) или изогнутые монокристаллы  и детекторы изображения (фотоплёнки, электроннооптические преобразователи. На рис. 4 приведена схема хода лучей в рентгеновском микроскопе с 2 зеркалами, повёрнутыми друг относительно друга на 90°.

Рис. 4. Схема фокусировки рентгеновских лучей в отражательном рентгеновском микроскопе с 2 скрещенными зеркалами: OO' — оптическая ось системы; А — объект; A' — его изображение. Увеличение O'A'/OA.

Получение высокого разрешения в отражательной рентгеновской микроскопии ограничивается малым углом полного внешнего отражения (угол скольжения < 0,5°), а следовательно, большими фокусными расстояниями (> 1 м) и очень жёсткими требованиями к качеству обработки поверхности зеркал.

При использовании для фокусировки рентгеновского излучения изогнутых монокристаллов, помимо геометрических искажений, на качество изображения влияют структурные несовершенства монокристаллов, а также конечная величина брэгговских углов дифракций.

 Отражательные рентгеновские  микроскопы не получили широкого  распространения из-за технических  сложностей их изготовления и  эксплуатации.

Проекционная рентгеновская микроскопия основана на принципе теневой проекции объекта в расходящемся пучке рентгеновских лучей, испускаемых «точечным» источником (рис. 5).

Рис. 5. Схема проекционного рентгеновского микроскопа с использованием широкофокусной рентгеновской трубки и камеры-обскуры.

Проекционные рентгеновские микроскопы состоят из сверхмикрофокусного источника рентгеновских лучей с фокусом 0,1—1 мкм в диаметре (например, специальная микрофокусная рентгеновская трубка или камера-обскура (диафрагма) в сочетании с обычной широкофокусной рентгеновской трубкой), камеры для размещения исследуемого объекта и регистрирующего устройства. Увеличение М определяется отношением расстояний от источника рентгеновского излучения до объекта (а) и до детектора (b): М = b/a (см. рис. 3).

Рис. 6. Образование полутени Pr и дифракционной «бахромы» в проекционном рентгеновском микроскопе.

Следовательно, объект должен находиться на малых расстояниях от источника рентгеновского излучения. Для этого фокус трубки располагается непосредственно на окне рентгеновской трубки либо на вершине иглы анода, помещенной вблизи окна трубки.

Линейное разрешение проекционных рентгеновских микроскопов достигает 0,1—0,5 мкм. Геометрическое разрешение определяется величиной нерезкости (полутени) края объекта Pr зависящей от размера источника рентгеновских лучей d и увеличения М: Pr = Md. Дифракционное разрешение зависит от дифракционной френелевской «бахромы» на крае: Pr = аλ1/2, где а — расстояние от источника до объекта. Поскольку а практически не может быть меньше 1 мкм, разрешение при λ = 1 Å составит 100 Å (если размеры источника обеспечат такое же геометрическое разрешение). Контраст в изображении возникает благодаря различному поглощению рентгеновского излучения в областях объекта с различной плотностью или составом; чувствительность метода проекционной Р. м. определяется отличием коэффициентов поглощения рентгеновского излучения различными участками исследуемого объекта.

Проекционная рентгеновская микроскопия находит широкое применение для исследований микроскопического строения различных объектов: в медицине, в минералогии, в металловедении и других областях науки и техники. С помощью рентгеновского микроскопа можно оценивать качество окраски или тонких покрытий, оклейки или отделки миниатюрных изделий. Он позволяет получать микрорентгенографии биологических и ботанических срезов толщиной до 200 мкм. Его используют также для анализа смеси порошков лёгких и тяжёлых металлов, при изучении внутреннего строения объектов, непрозрачных для световых лучей и электронов. Исследуемые образцы при этом не надо помещать в вакуум, как в электронном микроскопе, они не подвергаются разрушающему действию электронов. Применение в рентгеновских микроскопах различных преобразователей рентгеновских изображений в видимые в сочетании с телевизионными системами позволяет осуществлять оперативный контроль объектов в научно-исследовательских и производственных условиях.

Заключение

Зрительный анализатор человека играет важнейшую роль в познании окружающего мира. Именно со зрением мы получаем до 80% информации. Строение глаза достаточно сложно и многогранно, и его знание играет важную роль в понимании развития офтальмологических заболеваний.

Для расширения возможностей оптической системы глаза, человечество использует специальное оборудование. Благодаря ему появляются методы микроскопии, необходимые в научной деятельности. Световые, электронные и рентгеновские микроскопы представляют колоссальный объем данных гистологического строения тканей. Они позволяют делать микрофотографии, изучать срезы различной толщины, исследовать биопсийный, операционный и секционный материал, анализировать смеси порошков тяжелых и легких металлов, уточнять локализацию и количество определенных веществ, а в случае исследования живых объектов — показывают изменения в процессе их жизнедеятельности.