Спекрофотометрия, как метод в биофизике

Светофильтры  пропускают лучи лишь в определенном интервале длин волн, с полушириной  пропускания  (рис. 2). У хороших светофильтров размытость максимума пропускания превышает 20÷30 нм.

Рис. 2 Спектральная кривая светопропускания светофильтра                                                                                                

По сравнению  с фотоколориметрическими методами у спектрофотометрических следующие преимущества: повышенная чувствительность и точность количественного определения концентрации веществ;возможность анализа систем, содержащих несколько компонентов, не взаимодействующих друг с другом и имеющих различные спектральные коэффициенты поглощения;   возможность анализа растворов, которые бесцветны для глаза (при их исследовании в ультрафиолетовой 200÷400 нм или ближней инфракрасной 760÷1100 нм областях спектра).

2.3.Абсорбционная спектрофотометрия изучает изменение интенсивности электромагнитного излучения различной длины волны, вызванное взаимодействием излучения с веществом. Если среда, через которую проходит излучение от источника сплошного спектра прозрачна для излучения, то изменяется только скорость распространения излучения, которая становится меньше, чем в вакууме. Количественно уменьшение скорости выражается через показатель преломления п c / v, где сии - скорости распространения электромагнитного излучения в вакууме и в данной среде. Спектр поглощения такой прозрачной среды представляет собой непрерывную полосу. Если среда поглощает излучение, то наблюдаемый спектр содержит одну или несколько полос поглощения. Пламенная атомная абсорбционная спектрофотометрия, или пламенная абсорбционная спектрофотометрия, - процесс, во время которого атомы, ионы или ионные комплексы элемента, распыленного до основного состояния в пламени, поглощают свет при длине волны, характерной для данного элемента. В абсорбционной спектрофотометрии обычно имеют дело с достаточно мощными световыми потоками, когда роль темнового тока оказывается несущественной. Применение абсорбционной спектрофотометрии в видимой и ультрафиолетовой областях спектра для методик количественного определения основано на том факте, что поглощаемость вещества обычно является константой, независимой от интенсивности падающего излучения, длины кюветы и концентрации, вследствие чего концентрация может быть определена фотометрически. Метод абсорбционной спектрофотометрии основан на измерении светопоглощения в центре атомной линии при просвечивании паров анализируемого вещества. По чувствительности он превосходит эмиссионные спектральные методы, но несмотря на это редко применяется, поскольку резонансные линии брома лежат в труднодоступной для фотометрирования вакуумной УФ-области. Применены методы абсорбционной спектрофотометрии к анализу ароматических углеводородов С6 - С8 в ультрафиолетовой области спектра.   

2.4Дифференциальная (разностная) спектрофотометрия

При изучении биологических  систем часто необходимо измерить небольшие  изменения оптической плотности  на фоне сильного поглощения и светорассеяния образца. Это можносделать двумя способами.

1. Последовательно  измеряют  спектры поглощения  опытного образца D1 = -lg(I1/I0) и образца сравнения D2 = – lg (I2 / I0), затем вычитают из первой величины вторую и получают разностный спектр поглощения, т. е. кривую зависимости ΔD = D2 – D1 от длиныволны.

2. Непосредственно измеряют разностный  (дифференциальный) спектр поглощения без регистрации интенсивности света, прошедшего через пустую кювету (I0), сравнивают интенсивности света, прошедшего через опытный I2 и контрольный (I1) образцы:ΔD = – lg(I2 / I1). (1.23)

Метод разностной спектрофотометрии дает возможность определить величину ΔD с  бо´льшей точностью, чем при последовательном измерении спектров двух сравниваемых образцов. Выигрыш  в точности измерения тем выше, чем больше общая оптическая плотность, т. е. чем меньше отношение ΔD/D. метод разностной спектрофотометрии дает наибольшие

преимущества  при высокой оптической плотности  образца (кривая дана для D = 2) и малых величинах изменения оптической плотности в опытном образце по сравнению с контрольным.

___________________________________

¹Ю.А Владимиров,А .Я Потапенко Физико –химические основы фотобиологических процессов. М. «Высшая школа» ,1989, с .20 
 
 
 
 
 

2.5 ЛАЗЕРНАЯ  СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

 Основные положения:  Согласно используемым физическим принципам диагностики методы неинвазивной прижизненной спектрофотометрии позволяют оценивать in vivo (in situ) биохимический состав мягких тканей человека и его динамику во времени, включая изучение кратковременных и ритмичных флуктуаций всех наблюдаемых параметров, возникающих вследствие ритмичной работы сердечно-сосудистой и нервно-рефлектроной систем. Наиболее легко определяемыми в тканях параметрами являются :процентное содержание в крови различных фракций гемоглобина (оксигемоглобин, восстановленный гемоглобин и др.), водонасыщение тканей (их гидратация), содержание в поверхностных тканях меланина, жира, порфириновых , флавиновых  и пиридиннуклеотидовых ферментов. Изучение кратковременных флуктуаций параметров периферической микрогемодинамики на отрезках времени порядка 3-5 минут позволяет оценивать функциональное состояние сосудистого русла биологических тканей. А оценка длительных изменений в регистрируемых параметрах на протяжении суток, недель и месяцев позволяет проводить мониторинг эффективности лечения пациента и оценивать действие различных отдельных лечебных процедур. Поэтому, неинвазивная лазерная диагностика (спектрофотометрия) в медицине может быть эффективна в самых разных ее областях от онкологии, дерматологии и гастроэнтерологии до ангиологии, профпатологии, физиотерапии, эндокринологии, гинекологии и т.д.  В части регистрации параметров микрогемодинамики наиболее легко регистрируемыми методами неинвазивной биоспектрофотометрии являются: параметр перфузии тканей кровью, параметры частотных сосудистых ритмов, зависящих от нервно-рефлекторной и гуморальной регуляции периферического кровообращения а также параметры транспорта и утилизации кислорода в системе микроциркуляции: артериальная (SaO₂) и средняя артерио-венозная сатурация оксигемоглобина (S_tO₂) крови микроциркуляторного русла клеточной биоткани, удельное потребление кислорода тканями и т.п. [14, 15]). Наибольшей же  информативностью обладают все эти методы при использовании различных функциональных нагрузочных тестов и проб на систему микроциркуляции крови (окклюзионный тест, лекарственная проба, дыхательный тест и др.) [6, 8, 9, 12]. В частности, с помощью окклюзионной пробы достаточно наглядно, быстро и надежно можно получить данные о типе микроциркуляции крови у пациента (нормоциркуляторный тип микроциркуляции, ангиоспастический или гиперемический тип микроциркуляции [6, 15]). С помощью нашего прибора "Спектротест", пригодного для этих измерений, было также установлено, что в системе микроциркуляции крови, наряду с низкочастотными вазомоторными ритмами в перфузии тканей кровью, присутствуют и ритмы средней артерио-венозной сатурации     (оксигенации) крови микроциркуляторного русла биоткани .

Применение спектрофотометрии в УФ и видимой областях спектра основано на поглощении электромагнитного излучения соединениями, содержащими хромофорные (напр., С = С, С=С, С=О) и ауксохромные (ОСН₃, ОН, NH₂ и др.)). Поглощение излучения в этих областях связано с возбуждением электронов s-, p-и n-орбиталей основного состояния и переходами молекул в возбужденные состояния: s : s*, n : s*, p : p* и n : p* (переходы перечислены в порядке уменьшения энергии, необходимой для их осуществления;). Переходы s : s* находятся в далекой УФ области, например у парафинов при ~ 120 нм. Переходы n : s* наблюдаются в УФ области; например, органических соединений, содержащие n-электроны, локализованные на орбиталях атомов О, N, Hal, S, имеют Полосы поглощения при длине волны около 200 нм. Линии, соответствующие переходам p : p*, например, в спектрах гетероциклических соединений проявляются в области около 250-300 нм и имеют большую интенсивность. Полосы поглощения, соответствующие переходам n : p*, находятся в ближней УФ и видимой областях спектра; они характерны для соединений, в молекулах которых имеются такие хромофорные группы, как С = О, C = S, N = N. Так, насыщенных альдегиды и кетоны имеют максимумы поглощения при длине волны около 285 нм. Переходы типа n : p* часто оказываются запрещенными, и соответствующие полосы поглощения обладают очень малой интенсивностью.Переходы типа p : p* могут сопровождаться переходом электрона с орбитали, локализованной главным образом на одной группе (напр., С=С), на орбиталь, локализованную на др. группе (напр., С=О). Такие переходы сопровождаются переносом электрона с одного атома на другой и соответствующие спектры наз. спектрами с переносом заряда. Последние характерны для различных комплексов (например, ароматических соединений с галогенами), интенсивно поглощающих в видимой и УФ областях.Для ионов переходных металлов и их комплексных соединений характерны переходы с участием d-электронов, а для РЗЭ и актиноидов - переходы с участием f-электронов. Соответствующие соединения в растворе бывают интенсивно окрашенными, причем окраска (спектр поглощения) зависит от степени окисления катиона и устойчивости комплексного соединения. Поэтому спектрофотометрия широко используют при исследовании и анализе комплексных соединений металлов.Изолированные, не взаимодействующие между собой хромофоры в молекуле поглощают независимо. В случае какого-либо взаимодействия между ними аддитивность спектров нарушается. По отклонениям от аддитивности можно судить о характере и величине взаимодействия. Поскольку положение полос в спектре определяется как разность энергий основного и возбужденного состояний молекул, можно определять структуру энергетических уровней молекул или по известной схеме энергетических уровней определять положение полос поглощения. Любому электронному состоянию молекул соответствует набор различных колебательных уровней энергии. Колебательная структура полосы, соответствующей переходу между электронными уровнями, может отчетливо проявляться не только в спектрах газов, но и в спектрах некоторых растворов, что дает возможность получать дополнительную информацию о взаимодействии молекул. Спектрофотометрическое исследование спектров молекул в видимой и УФ областях позволяет установить вид электронных переходов и структуру молекул. При этом часто исследуют влияние различных типов замещения в молекулах, изменения растворителей, температуры и др. физ.-хим. факторов.В ИК области проявляются переходы между колебательными и вращательными уровнями (смотри Колебательные спектры, Вращательные спектры). Среди частот колебаний молекул выделяют так называемые характеристические, которые практически постоянны по величине и всегда проявляются в спектрах хим. соединений, содержащих определенные функциональные группы (вследствие чего эти частоты иногда называют групповыми). Теория колебаний сложных молекул позволяет расчетным путем предсказать колебательный спектр соединений, т. е. определить частоты и интенсивности полос поглощения.

Колебательные спектры молекул чувствительны не только к изменению состава и структуры (т.е. симметрии) молекул, но и к изменению различных физических и химических факторов, например изменению агрегатного состояния вещества, температуры, природы растворителя, концентрации исследуемого вещества в растворе, различные взаимодействия между молекулами вещества (ассоциация, полимеризация, образование водородной связи, комплексных соединений, адсорбция и т. п.). Поэтому ИК спектры широко используют для исследования, качественного и количественного анализа разнообразных веществ.В ближней ИК области (10000-4000 см^-1, или 1-2,5 мкм), где расположены обертоны и составные частоты основных колебаний молекул, полосы поглощения имеют интенсивность в 10²-10³ раз меньше, чем в средней ИК области (4000-200 см^-1). Это упрощает подготовку образцов, так как толщина поглощающего слоя может быть достаточно большой (до нескольких мм и более). Экспериментальная техника для работы в этой области относительно проста. Однако чувствительность и селективность определения отдельных соединений невелики. Тем не менее высокое отношение сигнал:шум (до 10⁵) создает хорошие условия для количеств. анализа при содержании определяемого соединений около 1% и выше. Подобные анализы выполняются за 1 мин. В дальней ИК области (200-5 см^-1) могут наблюдаться чисто вращательные переходы.Интенсивность полосы поглощения молекулы определяется вероятностью соответствующего электронного (или колебательного) перехода. Для характеристики интенсивности полосы служит молярный коэффициент поглощения e, определяемый, согласно закону Бугера-Ламберта-Бера, как e = A/Cl, где А = = — lgT= — lg(I/I₀), T-пропускание, I₀ и I-интенсивности соотв. падающего и прошедшего через вещество излучения, С-молярная концентрация вещества, поглощающего излучение, l-толщина поглощающего слоя (кюветы), в см. Обычно e<10⁵, в ИК области e<2•10³ (л/моль•см). Закон Бугера-Ламберта-Бера лежит в основе количественного анализа по спектрам поглощения.Для измерения спектров используют спектральные приборы-спектрофотометры, основные части которого: источник излучения, диспергирующий элемент, кювета с исследуемым веществом, регистрирующее устройство. В качестве источников излучения применяют дейтериевую (или водородную) лампу (в УФ области) и вольфрамовую лампу накаливания или галогенную лампу (в видимой и ближней ИК областях). Приемниками излучения служат фотоэлектронные умножители (ФЭУ) и фотоэлементы (фоторезисторы на основе PbS). Диспергирующими элементами прибора являются призменный монохроматор или монохроматор с дифракционными решетками. Спектр получают в графической форме, а в приборах со встроенной мини-ЭВМ - в графической и цифровой формах. Графически спектр регистрируют в координатах: длина волны (нм) и(или) волновое число (см^-1)-пропускание (%) и(или) оптическая плотность. Основные характеристики спектрофотометров: точность определения длины волны излучения и величины пропускания, разрешающая способность и светосила, время сканирования спектра. Мини-ЭВМ (или микропроцессоры) осуществляют автоматизированное управление прибором и различную математическую обработку получаемых экспериментальных данных: статистическую обработку результатов измерений, логарифмирование величины пропускания, многократное дифференцирование спектра, интегрирование спектра по различным программам, разделение перекрывающихся полос, расчет концентраций отдельных компонентов и т. п. Спектрофотометры обычно снабжаются набором приставок для получения спектров отражения, работы с образцами при низких и высоких температурах, для измерения характеристик источников и приемников излучения и т.п.Для исследования спектров в ИК области используют обычно спектрофотометры, работающие в интервале от 1,0 до 50 мкм (от 10000 до 200 см^-1). Основными источниками излучения в них являются стержень из карбида кремния (глобар), штифт из смеси оксидов циркония, тория и иттрия (штифт Нернста) и спираль из нихрома. Приемниками излучения служат термопары (термоэлементы), болометры, различные модели оптико-акустических приборов и пироэлектрические детекторы, например на основе дейтерированного триглицинсульфата (ТГС). В спектрофотометрах, сконструированных по "классической" схеме, в качестве диспергирующих элементов применяют призменный монохроматор или монохроматор с дифракционными решетками. С кон. 60-х гг. 20 в. выпускаются ИК фурье-спектрофотометры, которые обладают уникальными характеристиками: разрешающая способность-до 0,001 см^-1, точность определения волнового числа v-до 10^-4 см^-1 (относит. точность bDv/v ! ! 10 ^-8), время сканирования спектра может достигать 1 с, отношение сигнал:шум превышает 10⁵. Эти приборы позволяют изучать образцы массой менее 1 нг. К ним также имеются разл. приставки для получения спектров отражения, исследования газов при малых или высоких давлениях, разных температурах и т. п. Встроенная в прибор мини-ЭВМ управляет прибором, выполняет фурье-преобразования, осуществляет накопление спектров, проводит различную обработку получаемой информации.ИК фурье-спектрофотометры могут содержать программы по автоматической идентификации образца неизвестного состава и определению содержания примесей, например в полупроводниковых материалах.                                                       Спектрофотометрия широко применяют для исследования органических и неорганических веществ, для качественного и количественного анализа различных объектов (в частности, природных), для контроля технологических процессов. Так, разработаны спектрофотометрические методы определения в растворах Сu и Rb (пределы обнаружения 3•10^-6% по массе), Со (2,5 • 10 ^-5 % по массе), Hf и Zr (0,5 мкг/мл); V (0,2 мкг/мл), гликозидов (0,05 мкг), белков (0,2 мкг/мл), тимола (1-2 мкг/мл); в атмосфере можно определить СО, оксиды азота, этилен, О₃, NH₃, CH₄ с пределами обнаружения ~ 10^-7% по массе.² 
 
 

__________________

²Ельяшевич М. А., Атомная и молекулярная спектроскопия, М., 1962; Дайер Д. Р., Приложения абсорбционной спектроскопии органических соединений, пер. с англ., М., 1970; неорганических и координационных соединений, пер. с англ., М., 1991. Э. Г. Тетерин 
 

3. Качественный и количественный спектрофотометрический анализ

Качественный  спектрофотометрический анализ основывается на том, что каждое соединение имеет характерный для него спектр поглощения. Для идентификации вещества наиболее важны следующие параметры:

1) число максимумов в спектре поглощения,

2) положение (длина волны) каждого максимума;

3) значение коэффициентов поглощения в каждом из максимумов (в единицах s или ε);

4) отношение амплитуд максимумов, т. е. отношение коэффициентов поглощения в максимумах, если их несколько.

Сложность спектра поглощения зависит от того, какому числу электронных переходов между разными уровнями соответствуй данный спектр. Считается, что каждый электронный переход дает полосу поглощения, которая на графике представлена кривой, близкой к гауссовой кривой нормального распределения.

Количественный  спектрофотометрический анализ основан на применении закона Бугера-Ламберта-Бера .При количественном анализе можно одновременно определять концентрацию нескольких веществ, если спектры их поглощена различаются по форме. Суммарный спектр поглощения DΣ нескольких веществ есть простая сумма спектров поглощения компонентов, так как при всех длинах волн оптические плотности компонентов суммируются. Например, для двухкомпонентной смеси при любой длине волны DA+B = DA+ DB, где DA и DB – оптические плотности компонентов. Исходя из уравнения можно записать :DA+B = εAcAl + εBcBl (1.20)

Если молярные коэффициенты поглощения для обои х веществ εA и εB известны, равно как и толщина кюветы l, то найти неизвестные концентрации cA и cB все равно нельзя, еслиизмерения DA+B проводились при одной длине волны. Для двух разных длин волн случаютсистему из двух уравнений с двумя неизвестными, решив которую, находят обеконцентрации:

Dλ1 = (εAλ1) cAl + (εBλ1) cBl

Dλ2 = (εAλ2) cAl + (εBλ2) cBl

Выбранные две  длины волны λ1 и λ2 должны быть такими, для которых молярные коэффициенты поглощения компонентов (εAλ1), (εBλ1) и (εAλ2),(εBλ2)различаются больше всего; это не всегда соответствует максимумам в спектре поглощения веществ.Теоретически, если число длин волн, используемых для измерений, равно числу компонентов,можно проанализировать и более сложные смеси. На практике же редко удается осуществить количественный спектрофотометрический анализ более 2-3 соединений в одной смеси. Критерием правильности анализа может служить совпадение сконструированного спектра, рассчитанного после определения