Анализ азитромицина методом капиллярного электрофореза

Способы детектирования в КЭ и основные характеристики детекторов представлены в таблице [12].

 

Таблица 1. Характеристики методов детектирования применяемые в КЭ.

 

Термостатирование служит, главным образом, для отведения  Джоулева тепла. Самым простым вариантом охлаждения капилляра является сильный обдув комнатным воздухом. Кроме того, используют воздушные и жидкостные системы термостатирования капилляров, температура при этом может варьироваться от +4 до +70 °С и поддерживаться постоянной на уровне 0,1 °С. В коммерческих приборах, как правило, термостатируют только капилляры (или их часть), а в сосуде для буфера не всегда поддерживается такая же температура, как в капилляре. В ряде приборов имеется возможность термостатировать автозагрузчик пробы, что особенно полезно при анализе термолабильных образцов.

В качестве электролитов в КЭ применяются как правило  буферные системы [12]. Идеальный буфер для капиллярного электрофореза должен обладать следующими свойствами:

- достаточная буферная емкость в выбранном диапазоне рН;

- малое поглощение на длине волны детектирования;

- низкая подвижность ведущего иона.

 

 

Таблица 2. Наиболее распространенные буферные системы  в КЗЭ.

 

К достоинствам КЭ следует отнести следующее:

- высокая эффективность разделения, недоступная ВЭЖХ;

- малый объем анализируемой пробы и буферов;

- практически не требуется применение высокочистых, дорогостоящих органических растворителей;

- отсутствие колонки (старения сорбента), проблем с ее заменой;

- экспрессность и низкая себестоимость единичного анализа.

К недостаткам  КЭ относятся:

- невысокая, по сравнению с ВЭЖХ, концентрационная чувствительность определения;

- требование к анализируемым соединениям растворяться в воде и разбавленных водно-органических смесях.

 

 

 

 

 

Капиллярный электрофорез в фармацевтическом анализе

 

Обычно анализ состава лекарственного препарата  проводится физическими и химическими  методами. Такие показатели, как  подлинность, чистота, в том числе  энантиомерная, количественное определение индивидуальных компонентов лекарственных форм, с начала 1970-х годов проводили хроматографическими методами. Разделение методом КЭ отличается от типичных для хроматографии, поэтому появилась возможность альтернативного анализа при проведении этих определений. Следует отметить что КЭ в настоящее время находится в состоянии развития.

Пригодность КЭ была подтверждена многочисленными  государственными и международными инстанциями [12]. Теория метода КЭ сейчас включена в ведущие фармакопеи развитых стран. Стандартные методики КЭ успешно используются в работе Управления по контролю лекарств и пищевых продуктов США.

С помощью метода КЭ можно разделять водорастворимые  и водонерастворимые соединения, как ионизируемые так и неионизируемые.

Основные водорастворимые  лекарственные соединения разделяются  в буферных системах с низким значением  рН. При рН=2,5-5,0 даже слабоосновные  группы заряжены положительно и переносятся  к катоду, при этом ЭОП, тоже направленный к катоду, в этом случае минимален. Водонерастворимые основные вещества можно анализировать после растворения образца либо в смеси органического растворителя с водой, либо в разбавленных кислых растворах. Готовые к применению лекарственные формы, кроме основного компонента, содержат вспомогательные вещества. Для таблеток наполнителями обычно являются крахмал, тальк, магния стеарат и другие. При пробоподготовке для таблеток приходится вводить стадию центрифугирования для отделения нерастворяющихся компонентов. Сиропы содержат натрия бензоат, пропиленгликоль, глицерин, сахар. При низких значениях рН большинство добавок оказываются нейтральными, они очень медленно мигрируют со скоростью ЭОП. Таким образом, они фактически остаются во введенном объёме капилляра, не мешают разделению основного компонента и удаляются из капилляра только при последующей промывке.

Для разделения кислых лекарственных соединений используют буферные системы с рН более 7. Наиболее часто используется 10 мМ боратный буфер. При этом создается большой и стабильный ЭОП. Водонерастворимые препараты лекарственных средств, имеющие кислотные свойства, можно растворить в органических растворителях либо в водных растворах с высоким значением рН, но необходимо учитывать, что при этом некоторые соединения нестабильны (ацетилсалициловая кислота).

 

Рисунок 4. Электрофореграмма смеси цефалоспоринов.

 

В ряде работ  метод капиллярного электрофореза  используется для установления химического  состава лекарственных растений.

 

Рисунок 5. Электрофореграмма экстракта клевера.

 

Определение примесей в лекарственных препаратах имеет важное значение. Определяемые концентрации находятся в диапазоне от нескольких частей на миллиард до нескольких частей на миллион. Часто основной компонент и структурно родственные примеси имеют сходные химические свойства, что создает определенные трудности в оценке состава лекарственного средства. Явное преимущество капиллярного электрофореза перед хроматографическими методами заключается в его более высокой разделяющей способности.

 

Рисунок 6. Электрофореграмма субстанции рифампицина.

Стереоселективные лекарственные средства, как правило, сначала синтезируются как рацематы. Методу КЭ в анализе стереоселективных  соединений отводится очень важная роль, поскольку выявлены его явные  преимущества перед другими методами.

Если смесь  энантиомеров, которые необходимо разделить, добавить к оптически активной среде, то в разделяющей системе поведение  анализируемых веществ будет  столь отличным, что позволит осуществить  их разделение. Наиболее известными хиральными селекторами являются циклодекстрины [9].

 

Рисунок 7. Электрофореграмма раствора флуоксетина.

 

Для оценки качества антибиотиков в фармацевтическом анализе применяют:

- хроматографические методы (ВЭЖХ, ТСХ);

- спектроскопические методы (ИК-спектроскопия, УФ- спектроскопия);

- биологические методы; 

- химические методы.

Важнейшим методом анализа, который используется как для  идентификации, так и контроля чистоты  и количественного определения антибиотиков является ВЭЖХ [5,6]. Обычно используется обращённо-фазовый вариант ВЭЖХ со спектрофотометрическим детектированием. Для идентификации антибиотиков также используется ТСХ и спектроскопические методы (ИК- и УФ-спектроскопия), а для количественного определения - УФ-спектрометрия. Количественное определение некоторых антибиотиков, для которых ВЭЖХ-определение затруднено, проводят микробиологическим методом.

Для установления подлинности  азитромицина используют ИК-спектроскопию, ТСХ, химическими реакциями. Испытание  на чистоту проводят методами ГЖХ  и ТСХ [5,6].

 

 

Рисунок 8. Структурная формула азитромицина.

 

Для количественного  определения используют метод ВЭЖХ. Существуют так же методики определения  биологической активности методом  диффузии в агар [5,6].

 

 

 

Анализ азитромицина (Сумамед ©) методом

капиллярного  электрофореза

 

Анализ проводился на базе лаборатории ОКК ООО «Белфармаком». В качестве оборудования была использована система капиллярного электрофореза «Капель 105М» производства фирмы «Люмекс» (г. Санкт-Петербург) под управлением ПО «Эльфоран».

Пробоподготовка включала в себя приготовление раствора рабочего стандартного образца (РСО) из субстанции азитромицина дигидрата и приготовление раствора заданной концентрации из капсул Сумамед © 250 мг.

Для приготовления РСО использовалась субстанция азитромицина дигидрата предоставленная лабораторией ОКК «Белфармаком». Эмпирически было определено, что 10 мг азитромицина растворяются в 1 мл 0,1 М ортофосфорной кислоты. 50 мг субстанции азитромицина дигидрата было отвешено на весах аналитических весах в мерную колбу объёмом 100 мл. В колбу было добавлено 5 мл 0,1 М ортофосфорной кислоты. После нагревания на водяной бане при 70^оС 1 мин. помещению в ультразвуковую баню УЗВ-2/150-ТН на 1 мин. субстанция азитромицина дигидрата полностью растворилась. Получился прозрачный бесцветный раствор. После доведения водой очищенной до метки, произвели перемешивание. Раствор РСО имел концентрацию 0,05% азитромицина дигидрата. Раствор отобрали в виалу и произвели дегазацию на центрифуге ОПН-8 при 5 тыс. об. 5 мин.

Для приготовления анализируемого раствора использовали капсулы Сумамед © 250 мг производства фирмы «Плива» (Хорватия). Содержимое одной капсулы было помещено в мерную колбу 100 мл. В колбу было добавлено 25 мл 0,1 М ортофосфорной кислоты. После нагревания на водяной бане при 70^оС 1 мин.  помещено в ультразвуковую баню на 1 мин. Получился мутный белый раствор. Раствор был профильтрован через фильтр синяя лента, и 2 мл фильтрата перенесли пипеткой на 2 мл в мерную колбу 10 мл. После доведения водой очищенной до метки, произвели перемешивание. Анализируемый раствор имел концентрацию 0,05% азитромицина дигидрата. Раствор отобрали в виалу и произвели дегазацию на центрифуге при 5 тыс. об. 5 мин.

В качестве электролита  был использован боратный буфер  с рН=8,9. Его готовили следующим  образом. В химический стакан вместимостью 100 мл внесли 50 мл 10 мМ раствора тетрабората натрия и добавили 25 мл 10 мМ раствора борной кислоты. Раствор фильтровали через мембранный фильтр, отбросив первые 1,5 мл фильтрата, в виалу. Затем произвели дегазацию буфера на центрифуге при 5 тыс. об. 5 мин.

В процессе разработки методики использовались несколько  буферных систем. Наиболее подходящим электролитом оказался самый простой  боратный буфер. В методе КЗЭ он является одним из базовых. При попытке  использовать кислый электролит – фосфатный буфер рН=2,75 – были получены электрофореграммы, где пик азитромицина имел очень плохую симметрию и наблюдалась малая эффективность разделения. При использовании МЭКХ, электрофореграмма также огорчала.

Анализ проводили на кварцевом капилляре l=70/60 мм d=75 мкм. Температура термостатирования – 30^оС, длина волны детекции – 210 нм. Ввод пробы – гидродинамический, время ввода пробы – 15 с при давлении 30 мбар. Анализ проводился при напряжении 20 кВ без приложения дополнительного давления.

 

 

Рисунок 9. Электрофореграмма РСО азитромицина.

 

Время миграции азитромицина при анализе РСО составило 4,052 мин. Площадь пика составила 155,2.

По данным электрофореграммы  можно сделать несколько заключений. Азитромицин при движении в электрическом  поле ведёт себя как катион. Это можно заключить из того, что пик азитромицина приходится до появления маркера ЭОП на электрофореграмме [4]. Это объяснятся наличием основных центров в его молекуле. Определение азитромицина при использовании этой методики дает очень высокие показатели эффективности разделения – около 46 тысяч теоретических тарелок.

 

 

Рисунок 10. Электрофореграмма анализируемого раствора.

 

 

Время миграции азитромицина при анализе анализируемого раствора составило 3,980 мин. Площадь пика составила 157,2.

Нестабильность времени  миграции от анализа к анализу  является следствием нестабильности ЭОП, температурных эффектов, влияния  матричных и сопутствующих компонентов. Эта проблема решается введением  маркера ЭОП (например, ацетона) или  внутреннего стандарта.

Количественное содержание азитромицина рассчитывали по формуле:

 

Х = S₁ * a_o * P  * B / S_o, где

X – содержание в одной капсуле, г;

S₁ – площадь пика в анализируемом растворе;

a_o – аликвота субстанции в РСО, г;

P – коэффициент пересчёта субстанции на чистое вещество;

B – разведение;

S_o – площадь пика в растворе РСО.

 

Х = 0,231 г

Фармакопейная статья на азитромицин в капсулах 250 мг устанавливает содержание в пересчете на чистый азитромицин от 225 мг до 275 мг.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Вывод

 

Капиллярный электрофорез – высокоэффективный, экономичный  метод физико-химического анализа. Последние десятилетия происходит его широкое внедрение в такие  области, как анализ объектов окружающей среды, клиническая биохимия, криминалистика, пищевая промышленность. Не смотря на распространённость методов ВЭЖХ в фармацевтическом анализе, методы КЭ постепенно входят в ведущие фармакопеи мира и в дальшейшем ожидается рост их применения для анализа лекарственных препаратов.

Фармакопейная статья на азитромицин устанавливает как методы анализа для количественного определения ВЭЖХ и определение биологической активности.