Анализ лекарственных средств стероидной структуры

 

 

С помощью этой реакции можно отличить тестостерона пропионат от лекарственных веществ, не являющихся эфирами.

Для испытания на подлинность применяют (ФС) цветную реакцию на стероидные соединения с концентрированной серной кислотой. Метилтестостерон и мегандриол образуют при этом желто-оранжевое окрашивание с характерной зеленой флуоресценцией, а метандиенон — красное окрашивание. Подлинность тестостерона пропионата и метилтестостерона по МФ устанавливают с помощью ТСХ на адсорбенте кизельгур Р-1, в качестве проявителя используют раствор 4-толу- олсульфоновой кислоты в этаноле. Метод ТСХ рекомендован ФС для испытания подлинности тестостерона пропионата путем сравнения с ГСО. В тех же условиях определяют примеси посторонних стероидов в четырех указанных лекарственных веществах. Испытание выполняют на пластинках «Силуфол УФ-254», используя растворы анализируемых и стандартных образцов веществ-свидетелей (или ГСО) в хлороформе. Хроматограммы после высушивания просматривают в УФ-свете при 254 нм. Наличие допустимых количеств примесей (не более 1%) оценивают по совокупности величин и интенсивности пятен испытуемого лекарственного вещества и свидетеля. В метандиеноне устанавливают наличие примеси селена (не более 0,01%) методом сжигания в кислороде с последующей спектрофотометрией продукта взаимодействия селена с 3,3-диаминобензидина тетрагидрохлоридом в толуольном извлечении при длине волны 413 нм.

Метод УФ-спектрофотометрии ФС и МФ рекомендуют для испытания подлинности и количественного определения андрогенных и анаболических лекарственных веществ. Растворы в этаноле имеют максимумы поглощения у тестостерона пропионата при длине волны 240 нм, метилтестостерона — при 241 нм, метандиенона — при 245 нм. В метандриоле определяют светопоглощающие примеси, измеряя оптическую плотность (не более 0,5) 0,5%-ного раствора испытуемого вещества в этаноле при длине волны 240 нм. В соответствии с требованиями ФС в максимумах поглощения выполняют спектрофотометрическое определение указанных лекарственных веществ, используя растворитель этанол, который служит также раствором сравнения. Расчет содержания выполняют по удельному показателю поглощения (метилтестостерон — 540; метандиенон — 516) или по ГСО (тестостерона пропионат).

Метандриол количественно определяют (по ФС) поляриметрическим методом. Измеряют величину угла вращения спиртового раствора навески и рассчитывают содержание метандриола по величине удельного вращения.

Для надежной идентификации андрогенных и анаболических стероидов были использованы Н-ЯМР и масс-спектры. Выявлены химические сдвиги стандартных синглетных сигналов протонов С-18 и С-19, а также основные и характеристические ионы масс-спектров, полученных методом электронного удара. Для количественного определения применен также метод ВЭЖХ (Э.С. Матыев, А.П. Арзамасцев).

Андрогенные и анаболические стероидные лекарственные вещества хранят по списку Б, в хорошо укупоренной таре, предохраняя от действия света и влаги, под влиянием которых они могут постепенно разлагаться.

Тестостерона пропионат применяют как андрогенное лекарственное средство при климактерических, сосудистых и нервных расстройствах, а также для лечения рака молочной железы и яичников у женщин. Назначают его в виде 1%-ных или 5%-ных масляных растворов подкожно и внутримышечно. Метилтестостерон обладает аналогичным, но в 2-3 раза менее активным андрогенным действием. Он эффективен при приеме внутрь и подъязычном применении. Выпускают метилтестостерон в таблетках по 0,005 и 0,01 г. Метандиенон и метандриол обладают анаболическим действием, назначают их при нарушениях белкового обмена вследствие тяжелых травм, при коронарной недостаточности, язвенной болезни, инфаркте миокарда и т. д. Выпускают таблетки метандиенона по 0,005 г и метандриола по 0,25 г.

 

Глава 3. Эстрогенные гормоны

3.1 История

 

Эстрогенные или женские половые гормоны выделяются яичниками. В последних секретируются два типа гормонов: фолликулярные, или эстрогенные, вырабатываемые клетками созревающего фолликула и прогестенальный гормон (прогестерон), секретируемый клетками желтого тела, образующегося на месте разорвавшегося фолликула. Эстрогенные гормоны обеспечивают развитие женских половых органов, вызывают периодическое наступление овуляции, разрастание слизистой оболочки матки, подготовку ее к воспринятию яйца и развитию плода. Эстрогенные гормоны вызывают также развитие вторичных женских половых признаков. У животных эстрогенные гормоны вызывают течку. Течка вызывается также введением кастрированным животным (мышам) экстрактов яичника, и на этом явлении основан важнейший метод испытания активности женских половых гормонов, разработанный Алленом и Дойзи (1923 г.). У мышей и крыс отдельные стадии полового цикла распознаются при рассматривании под микроскопом мазка, взятого из влагалища, содержащего ороговевшие эпителиальные клетки. По методике авторов, исследуемое вещество растворяют в масле и вводят подкожно тремя порциями в течение 24 ч. Одной мышиной единицей (ME) называют наименьшее количество вещества, которое у 70% мышей вызывает явления эструса. По международному соглашению 1939 г. для стандартизации женских гормонов используется кристаллический препарат, под названием эстрон, 0,1γ которого представляет собой 1 международную единицу (1 ME) эстрогенной активности. Чувствительность метода позволяет определить 0,1γ эстрона; чувствительность повышается при интравагинальном введении.

Выделение женского гормона долгое время представляло большие трудности, так как экстракты из яичников, наряду с гормонами, содержат большое количество примесей. Более пригодный источник эстрогенных гормонов был найден Цондеком в 1927 г., когда было установлено, что эстрогены содержатся в значительном количестве в моче беременных женщин. Исследованиями Бутенандта с сотр. (1939) и Онесона с сотр. (1952) найдено, что в моче беременных эстрон содержится в виде сульфата (I) и частично в виде глюкоронида (II):

 

 

Получение эстрона Бутенандтом проводилось путем гидролиза мочи соляной кислотой и последующего извлечения гормона эфиром. После нейтрализации эфирного экстракта раствором гидрокарбоната натрия экстракт упаривался и экстрагировался толуолом. Из толуола гормоны извлекались 0,1 н. раствором едкого натра. Из 2 т мочи было выделено около 25 мг эстрона.

В дальнейшем, когда было найдено, что женские гормоны в значительно больших количествах содержатся в моче жеребых кобылиц и в моче жеребцов или меринов, были разработаны производственные методы получения эстрона.

По методу М.Н. Лапинера (1936) гидролизованная моча жеребых кобылиц извлекается хлороформом и после отгонки растворителя остаток распределяется между эфиром и раствором щелочи; кристаллизацией из спирта получают эстрон с примесью эквилина (III) и эквиленина (IV):

 

 

При очистке большую помощь оказали реактивы Жирара Т и Р:

 

 

которые благодаря превращению гормона в растворимое соединение способствовали его изолированию. При последующем подкислении соляной кислотой выделялся кетон, который экстрагировался подходящим растворителем. Таким образом, Бутенандтом были выделены из мочи эстрадиол (V) и эстриол (VI). При нагревании эстриола с бисульфатом калия был выделен эстрон, чем подтверждено строение последнего; так как эстриол содержит три гидроксильные группы, то, следовательно, две из них расположены рядом. При сплавлении эстриола с едким кали получена дикарбоновая кислота (VII), которая при нагревании дала ангидрид (VIII), а не кетон, что указывало на наличие в молекуле эстриола (и, следовательно, эстрона) пятичленного кольца:

 

 

При нагревании кислоты (VII) с селеном был выделен 1,2-диметилфенантрол-7 (VIIIa), строение которого было подтверждено синтезом:

 

 

ространственное строение эстрона было доказано синтезом из дегидроэпиандростерона (IX) эстрадиола (XV) (Ингоффен) по схеме:

 

 

Важным доказательством в этой схеме строения эстрадиола явилось бромирование (XII) и получение дибромпроизводного (XIII), оказавшегося транс-кетоном. Транс-кетоны такого типа в отличие от цис-изомеров бромируются в положении 2 и 4, а цис-кетоны только в положении 4.

Образование других продуктов (X, XI, XII, XIV и XV) ясно из схемы.

Эстрогенные гормоны присущи животным организмам, но они найдены и в растениях, например эстрон, в вытяжке из кокосовых орехов и в женских цветках ивы.

Вначале, когда химия стероидных эстрогенов была недостаточно развита, применялись различные препараты: фолликулин — водный раствор, получаемый из очищенных экстрактов мочи жеребцов, беременных женщин и др., консервированный трикрезолом, масляный раствор фолликулина (Folliculinum oleosum), приготовленный из кристаллических препаратов смеси эстрона и его дигидропроизводного; масляный раствор эстрона, содержащий в 1 мл 0,5—1 мг кристаллического гормона, масляный раствор эстрона, содержащий в 1 мл 0,5—1 мг кристаллического гормона, масляный раствор бензоата фолликулина (Folliculinum benzoatum s. Solutio Folliculim benzoati oleosa).

В настоящее время эти препараты отсутствуют в ГФ и используются лишь более эффективные, к которым принадлежат эстрадиол-монобензоат и эстрадиол-дипропионат, применяемые в виде масляных растворов.

3.2 Эстрадиол-монобензоат

 

 

Estradiolum monobenzoicum. Эстрадиол-монобензоат. 3-монобензойный эфир β-эстрадиола. С₂₅Н₂₃О₃. М = 376,5.

Получают бензоилированием эстрадиола хлористым бензоилом по схеме:

 

 

Продукт реакции промывают раствором едкого натра и перекристаллизовывают из спирта.

Эстрадиол-монобензоат — белый или желтоватый кристаллический порошок, без запаха, т. к. 191—196°, легко растворим в спирте и ацетоне, малорастворим в растительных маслах, не растворим в воде. Концентрированной серной кислотой окрашивается в зеленовато-желтый цвет с голубой флуоресценцией; при добавлении воды окраска переходит в бледножелтую. Чистоту препарата определяют по отсутствию эстрона (спиртовой раствор при нагревании со спиртовым раствором м-динитробензола и последующем действии едкого кали не должен окрашиваться в красный цвет).

Количественное определение препарата производят биологическим путем. 1 мг его должен содержать 10000ЕД (допускается отклонение от указанной активности ±25°о). Хранят с предосторожностью (список Б), в хорошо закупоренных склянках, в сухом месте, защищенном от действия света.

Эстрадиол является естественным гормоном, так как образуется в организме женщины вместе с эстроном. Являясь эфиром эстрадиола, он медленно всасывается и обладает пролонгированным действием.

Выпускают в ампулах по 1 мл 0,1%-ного раствора в масле для внутримышечного введения.

3.3 Эстрадиол-дипропионат

 

Estradiolum dipropionicum. Эстрадиол-дипропионат. Эфир эстрадиола и пропионовой кислоты. С₂₃Н₃₁О₄. М = 371,25.

 

 

Синонимы: Progynon, Synformon и др.

Получают этерификацией эстрадиола пропионовым ангидридом или хлорангидридом пропионовой кислоты:

 

 

Эстрадиол-дипропионат — белый кристаллический порошок, не растворим в воде, растворяется в спирте, эфире, растительных маслах. При щелочном гидролизе образует эстрадиол, т. пл. 191—196°, и дает все реакции, характерные для последнего. Чистоту препарата и количественное содержание его определяют аналогично эстрадиол-бензоату.

Препарат обладает замедленным и продолжительным эстрогенным действием.

Хранят с предосторожностью (список Б), в защищенном от света месте.

Применяют для тех же целей, как и эстрадиол-бензоат, в виде 0,1 %-ного масляного раствора в ампулах по 1 мл 2—3 раза в неделю.

Следует упомянуть, что сам эстрадиол существует в виде двух эпимерных диолов, с т. пл. 178° и т. пл. 223°. Низкоплавкий изомер обладает более подвижной гидроксильной группой и ему приписывается 17β-конфигурация (I); он активнее своего 17α-эпимера (II) примерно в 40 раз и в 8—10 раз активнее эстрона:

 

 

При обработке метилового эфира эстрадиола (I) литием в жидком аммиаке в присутствии спирта (по Берчу) восстанавливается ароматическое ядро и образуется виниловый эфир (II), который после гидролиза переходит в непредельный кетон —нортестостерон (III), являющийся одним из активных андрогенов:

 

 

 

Таким образом, превращение ароматического ядра в циклогексановое сопровождается исчезновением эстрогенной и возникновением андрогенной активности. С другой стороны, разрушение кольца D, при сплавлении эстрона (IV) с едким кали, приводит к монокарбоновой дойзиноловой кислоте (V), которая столь же активна, как и эстрон:

 

 

Следовательно, и без кольца D молекула способна обладать эстрогенной активностью.

3.4 Определение подлинности препаратов эстрогенов

 

Для установления подлинности используют цветную реакцию с концентрированной серной кислотои в присутствии этинилэстрадиола раствор приобретает оранжево-красную окраску с желтовато-зеленой флуоресценцией. После добавления полученного раствора к 10 мл воды окраска изменяется до фиолетовой и выпадает фиолетовый осадок Местранол с концентрированной серной кислотой образует кроваво-красное окрашивание с аналогичной флуоресценцией. Эстрадиола дипропионат под действием концентрированной серной кислоты гидролизуется с образованием эстрадиола и пропионовой кислоты. Последующее нагревание в присутствии этанола ведет к образованию этилового эфира пропионовой кислоты, имеющего характерный запах:

 

 

Эстрадиола дипропионат идентифицируют по образованию эстрадиола (т. пл. 173-179°С) после щелочного гидролиза с последующей очисткой его от примесей.

Наличие фенольного гидроксила в молекуле этинилэстрадиола подтверждают реакцией образования бензоата этинилэстрадиола, имеющего т. пл. 199-202°С:

 

 

УФ-спектр поглощения раствора этинилэстрадиола в смеси этанола и гидроксида натрия в области 220-330 нм имеет максимумы поглощения при 241 и 299 нм и минимумы поглощения при 226 и 271 нм, а раствор в этаноле — максимум поглощения при 280 нм. Этинилэстрадиол можно отличить по удельному показателю поглощения 0,005%-ного спиртового раствора при длине волны 280 нм. Он должен быть равен 65-69. Эстрадиола дипропионат идентифицируют по УФ-спектру 0,01%-ного раствора в этаноле, который в области 220-350 нм должен иметь два максимума поглощения (при 269 и 276 нм). Местранол (0,005%-ный раствор в этаноле или метаноле) при длине волны 279 нм имеет удельный показатель поглощения от 59 до 64.

Подлинность этинилэстрадиола, местранола и эстрадиола дипропионата подтверждают по ИК-спектрам, снятым в вазелиновом масле в области от 4000 до 200 см^-1. Они не должны отличаться от рисунков спектров, прилагаемых к ФС. В результате проведенных систематических исследований разработана унифицированная методика идентификации стероидных эстрогенов методом ВЭЖХ.