Биологическое окисление

 

  Митохондрии бурой  жировой ткани – генераторы  тепла.

 

 Всем позвоночным в  молодом возрасте для образования  тепла, в дополнение к механизму  мышечного тремора, необходимо  термогенное устройство. Такого рода устройство особенно важно для животных, впадающих в зимнюю спячку. Мышцы в состоянии тремора сокращаются и при отсутствии нагрузки, используя сократительные белки для гидролиза АТФ обычным для мышечных клеток образом и освобождая в виде тепла всю энергию, потенциально доступную при гидролизе АТФ. Необходимость особого термогенного устройства определяется прочно сопряженным окислительным фосфорилированием нормальных митохондрий. Если бы этот процесс мог быть разобщен, как это бывает в присутствии динитрофенола, он мог бы служить в качестве адекватного приспособления, производящего тепло; именно так это происходит в митохондриях бурого жира. Хотя эти митохондрий обладают обычной обратимой АТФазой, в них имеется также трансмембранная протонная транслоказа, посредством которой протоны могут возвращаться в матрикс и электрически шунтировать работу АТФазы. Если этот процесс достаточен для того, чтобы поддерживать окислительно-восстановительный потенциал водорода значительно ниже 200 мВ, синтез АТФ становится невозможным и окислительный процесс протекает свободно, в результате чего вся энергия освобождается в виде тепла.[2, 1994]

 

Цикл лимонной кислоты (цикл трикарбоновых кислот, цикл Кребса).

 

  Цикл лимонной кислоты  представляет собой серию реакций,  протекающих в митохондриях, в  ходе которых осуществляется  катаболизм ацетильных групп  и высвобождение  водородных  эквивалентов;  при  окислении   последних поставляется свободная  энергия топливных ресурсов тканей. Ацетильные группы находятся  в составе ацетил-КоА (активного ацетата), тиоэфира кофермента А.

 

Главная функция цикла  лимонной кислоты состоит в том, что он является общим конечным путем  окисления углеводов, белков и жиров, поскольку в ходе метаболизма  глюкоза, жирные кислоты и аминокислоты превращаются либо в ацетил-СоА, либо в промежуточные соединения цикла. Цикл лимонной кислоты играет также главную роль в процессах глюконеогенеза, переаминирования, дезаминирования и липогенеза, Хотя ряд этих процессов протекает во многих тканях, печень - единственный орган, в котором идут все перечисленные процессы. Поэтому серьезные последствия вызывает повреждение большого числа клеток печени или замещение их соединительной тканью. О жизненно важной роли цикла лимонной кислоты свидетельствует и тот факт, что у человека почти не известны генетические изменения ферментов, катализирующих реакции цикла, так как наличие таких нарушений несовместимо с нормальным развитием.[10,1993]

 

                                                             Открытие ЦТК.

 

Впервые предположение о  существовании такого цикла для  окисления пирувата в животных тканях было высказано в 1937 году Гансом Кребсом. Эта идея родилась у него, когда он исследовал влияние анионов различных органических кислот на скорость поглощения кислорода суспензиями измельченных грудных мышц голубя, в которых происходило окисление пирувата.   Грудные   мышцы   отличаются   чрезвычайно   высокой интенсивностью дыхания, что делает их особенно удобным объектом для изучения окислительной активности. Кребс также подтвердил, что обнаруженные ранее в животных тканях другие органические кислоты (янтарная, яблочная, фумаровая и щавелевоуксусная) стимулируют окисление пирувата. Кроме того, он нашел, что окисление пирувата мышечной тканью стимулируется шестиуглеродными трикарбоновыми кислотами - лимонной, цис-аконитовой и изолимонной, а также пятиуглеродной a-кетоглутаровой кислотой. Испытаны были и некоторые другие встречающиеся в природе органические кислоты, но ни одна из них не обнаружила подобной активности. Обращал на себя внимание сам характер стимулирующего действия активных кислот: даже малого количества любой из них было достаточно для того, чтобы вызвать окисление во много раз большего количества пирувата.[9, 1991]

 

Простые эксперименты, а также  логические рассуждения позволили Кребсу высказать предположение, что цикл, который он назвал циклом лимонной кислоты, является главным путем окисления углеводов в мышце. После, цикл лимонной кислоты был обнаружен практически во всех тканях высших животных и растений и у многих аэробных микроорганизмов. За это важное открытие Кребс был удостоен в 1953 году Нобелевской премии. Юджин Кеннеди и Альберт Ленинджер показали позднее, что все реакции цикла лимонной кислоты протекают в митохондриях животных клеток. В изолированных митохондриях печени крысы были обнаружены не только все ферменты и коферменты цикла лимонной кислоты; здесь же, как выяснилось, локализованы все ферменты и белки, которые требуются для последней стадии дыхания, т.е. для переноса электронов и окислительного фосфорилирования. Поэтому митохондрии с полным правом называют «силовыми станциями» клетки.

Катаболическая роль цикла лимонной кислоты

 

Цикл начинается со взаимодействия молекулы ацетил-СоА с щавелевоуксусной кислотой (оксалоацетатом), в результате которого образуется шестиуглеродная трикарбоновая кислота, называемая лимонной. Далее следует серия реакций, в ходе которых происходит высвобождение двух молекул С02 и регенерация оксалоацетата. Поскольку количество оксалоацетата, необходимое для превращения большого числа ацетильных единиц в С02, весьма невелико, можно считать, что оксалоацетат выполняет каталитическую роль.

 

Цикл лимонной кислоты  является механизмом, обеспечивающим улавливание большей части свободной  энергии, освобождаемой в процессе окисления углеводов, липидов и  белков. В процессе окисления ацетил-СоА благодаря активности ряда специфических дегидрогеназ происходит образование восстановительных эквивалентов в форме водорода или электронов.   Последние   поступают   в   дыхательную   цепь;   при функционировании этой цепи происходит окислительное фосфорилирование, то есть синтезируется АТФ.

 

Ферменты цикла лимонной кислоты локализованы в митохондриальном матриксе, где они находятся либо в свободном состоянии, либо на внутренней поверхности внутренней митохондриальной мембраны; в последнем случае облегчается перенос восстановительных эквивалентов на ферменты   дыхательной   цепи,   локализованные   во   внутренней митохондриальной мембране.[11, 1989]

 

Реакции ЦТК.

 

Начальная реакция - конденсация  ацетил-СоА и оксалоацетата, катализируется конденсирующим ферментом, цитратсинтетазой, при этом происходит образование связи углерод-углерод между метальным углеродом ацетил-СоА и карбонильным углеродом оксалоацетата. За реакцией конденсации, приводящей к образованию цитрил-СоА, следует гидролиз тиоэфирной связи, сопровождающийся потерей большого количества свободной энергии в форме теплоты; это определяет протекание реакции слева на право до ее завершения:

 

Ацетил-СоА + Оксалоацетат + Н2О → Цитрат + CoA-SH

 

Превращение цитрата в  изоцитрат катализируется аконитазой, содержащей железо в двухвалентном состоянии. Эта реакция осуществляется в две стадии: сначала происходит дегидратация с образованием цис-аконитата (часть его остается в комплексе с ферментом), а затем - гидратация и образование изоцитрата:

 

Цитрат ↔ цис -Аконитат ↔ Изоцитрат – Н2О

 

Реакция ингибируется фторацетатом, который сначала превращается во фторацетил-СоА; последний конденсируется с оксалоацетатом, образуя фторцитрат.   Непосредственным   ингибитором   аконитазы   является фторцитрат, при ингибировании накапливается цитрат.

 

Эксперименты  с  использованием   промежуточных  соединений показывают, что аконитаза взаимодействует с цитратом ассиметрично: она всегда действует на ту часть молекулы цитрата, которая образовалась из оксалоацетата.  Возможно, что цис-аконитат не является обязательным интермедиатом между цитратом и изоцитратом и образуется на боковой ветви основного пути.

 

Далее изоцитратдегидрогеназа катализирует дегидрогенирование с образованием  оксалосукцината.  Описаны три различных формы изоцитратдегидрогеназы. Одна из них, НАД-зависимая, найдена только в митохондриях. Две другие формы являются НАДФ-зависимыми, причем одна из них также находится в митохондриях, а другая в цитозоле. Окисление изоцитрата,  связанное с работой дыхательной цепи, осуществляется почти исключительно НАД-зависимым  ферментом:

 

Изоцитрат   +   НАД+ ↔ Оксалосукцинат   (в   комплексе   с ферментом) ↔ альфакетоглутарат + СО2+ НАДН2

 

Рисунок 5. Реакции цикла  Кребса.[10,1993]

 

Далее    следует    декарбоксилирование     с     образованием альфакетоглутарата,        которое        также        катализируется изоцитратдегидрогеназой.      Важным      компонентом      реакции декарбоксилирования являются ионы Mg2+ (или Мn2+). Судя по имеющимся данным, оксалосукцинат, образующийся на промежуточной стадии реакции, остается в комплексе с ферментом.

 

Альфакетоглутарат, в свою очередь, подвергается окислительному декарбоксилированию, сходному с окислительным декарбоксилированием пирувата: в обоих случаях субстратом является альфакетокислота. Реакция катализируется альфакетоглутаратдегидрогеназным комплексом и требует участия того же набора кофакторов - тиаминдифосфата, липоата, НАД+, ФАД и СоА; в результате образуется сукцинил-СоА - тиоэфир, содержащий высокоэнергетическую связь.

 

α-кетоглуторат + НАД+ + CoA-SH → Сукцинил-СоА + СО2 + НАДН+Н+

 

Равновесие реакции настолько  сильно сдвинуто в сторону образования  сукцинил-СоА, что ее можно считать физиологически однонаправленной. Как и при окислении пирувата, реакция ингибируется арсенатом, что приводит к накоплению субстрата (альфакетоглутарат).

 

Продолжением цикла является превращение сукцинил-СоА в сукцинат, катализируемое сукцинаттиокиназой (сукцинил-СоА-синтетазой):

 

Сукцинил-СоА + ФН + ГДФ↔ Сукцинат + ГТФ + CoA-SH

 

Одним из субстратов реакций  является ГДФ (или ИДФ), из которого в присутствии неорганического  фосфата образуется ГТФ (ИТФ). Это - единственная стадия цикла лимонной кислоты, в  ходе которой генерируется высокоэнергетическая фосфатная связь на субстратном  уровне; при окислительном декарбоксилировании  α-кетоглутарата потенциальное количество свободной энергии достаточно для образования НАДН и высокоэнергетической фосфатной связи. В реакции, катализируемой фосфокиназой, АТФ может образовываться как из ГТФ, так и из ИТФ. Например:

 

ГТФ+АДФ «ГДФ+АТФ.

 

В альтернативной реакции, протекающей  во внепеченочных тканях и катализируемой сукцинил-СоА-ацетоацетат-СоА-трансферазой, сукцинил-СоА превращается в сукцинат сопряженно с превращением ацетоацетата в ацетоацетил-СоА.    Впечени    имеется    диацилазная    активность, обеспечивающая гидролиз части сукцинил-СоА с образованием сукцината и СоА.

 

Далее сукцинат дегидрогенируется, затем присоединяется молекула воды, и следует еще одна стадия дегидрогенирования, приводящая к регенерации оксалоацетата:

 

Сукцинат + ФАД « Фумарат + ФАДН2

 

Первое дегидрогенирование катализируется сукцинатдегидрогеназой, связанной с внутренней поверхностью внутренней митохондриальной мембраны. Это единственная дегидрогеназная реакция ЦТК, в ходе которой осуществляется прямой перенос с субстрата на флавопротеин без участия НАД+. Фермент содержит ФАД и железо-серный белок. В результате дегидрогенирования образуется фумарат. Как показали эксперименты с использованием изотопов, фермент стереоспецифичен к транс-атомам водорода метиленовых групп сукцината. Добавление малоната или оксалоацетата ингибирует сукцинатдегидрогеназу, что приводит к накоплению сукцината.

 

Фумараза (фумаратгидротаза) катализирует присоединение воды к фумарату с образованием малата:

 

Фумарат +Н2О « L-малат

 

Фумараза специфична к L-изомеру малата, она катализирует присоединение компонентов молекулы воды по двойной связи фумарата в транс-конфигурации. Малатдегидрогеназа катализирует превращение малата в оксалоацетат, реакция идет с участием НАД+:

 

L-малат + НАД+ « 0ксалоацетат + НАДН2

 

Хотя равновесие этой реакции  сильно сдвинуто в направлении малата, реально она протекает в направлении оксалоацетата, поскольку он вместе с НАДН постоянно потребляется в других реакциях.

 

Ферменты   цикла   лимонной   кислоты,    за   исключением альфакетоглутарат- и сукцинатдегидрогеназы, обнаруживаются и вне митохондрий. Однако некоторые из этих ферментов (например, малатдегидрогеназа) отличаются от соответствующих митохондриальных ферментов.

 

Энергетика цикла лимонной кислоты.

 

 В результате окисления,  катализируемого дегидрогеназами ЦТК, на каждую катаболизируемую за период одного цикла молекулу ацетил-СоА образуются три   молекулы НАДН и одна молекула ФАДН2. Эти восстановительные эквиваленты передаются в дыхательную цепь, локализованную в митохондриальной мембране. При прохождении по цепи восстановительные     эквиваленты     НАДН     генерируют     три высокоэнергетические фосфатные связи посредством образования АТФ из АДФ в процессе окислительного фосфорилирования. За счет ФАДН2 генерируется только две высокоэнергетические фосфатные связи, поскольку ФАДН2 переносит восстановительные эквиваленты на кофермент Q и, следовательно,   в обход первого участка цепи  окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи. Еще один высокоэнергетический фосфат генерируется на одном из участков цикла лимонной кислоты, то есть на субстратном уровне, при превращении сукцинил-СоА в сукцинат. Таким образом,   за   период   каждого   цикла   образуется   12   новых высокоэнергетических фосфатных связей.

 

Регуляция цикла лимонной кислоты.