Гидролиз белков

Ферментативный гидролиз целлюлозы осуществляют целлюлазы (эндо- и экзоглюканазы). Продукты гидролиза - глюкоза и целлобиоза.

Гемицеллюлозы также принадлежат к группе полисахаридов. Они не растворимы в воде, но растворимы в щелочах и легче гидролизуются кислотами, чем целлюлоза. Гемицеллюлозы делят на две группы: гексозаны и пентозаны, состоящие из остатков различных моносахаридов и их производных[7].

Гексозаны __ высокомолекулярные соединения. Могут быть линейные или разветвленные. Основным представителем является β-глюкан, в котором остатки глюкозы соединены β-1,3 и β-1,4-глюкозидными связями.

Пентозаны имеют ветвистое строение, состоят из остатков пентоз (сахаров с пятью атомами углерода) - ксилозы, арабинозы, а также небольшого количества галактуроновой кислоты. Основной тип связей - β-1,4, в местах ветвления - β-1,3. Представителями пентозанов являются ксиланы, арабаны и арабиноксиланы.

Гумми-вещества близки по составу к гемицеллюлозам. Это продукты незавершенного гидролиза или синтеза гемицеллюлоз. Состоят из глюкозы, галактозы, ксилозы, арабинозы и остатков уроновых кислот. Растворимы в горячей  воде, дают растворы с высокой вязкостью.

Гидролиз всех вышеназванных соединений происходит под действием трех групп цитолитических ферментов: β-глюканаз (например, эндо-β-1,3-глюканаза; экзо-β-1,4-глюканаза), β-ксиланаз и β-глюкозидазы (экзофермент, расщепляет с нередуцирующего конца β-1,4-связь, с образованием глюкозы). Ферменты действуют поэтапно. На первом этапе гидролиза эндо-ферменты действуют беспорядочно и уменьшают молекулярную массу гемицеллюлоз. На втором этапе гидролиза действуют экзо-ферменты, которые производят осахаривающее действие.

В результате гидролиза некрахмальных полисахаридов образуются глюкоза, арабиноза, ксилоза, уроновые кислоты, декстрины. Глубина ферментативного гидролиза всего комплекса гемицеллюлоз находится в зависимости от состава ферментов, т.е. от наличия всех составляющих гемицеллюлазного и пентозаназного комплекса ферментов, а также от химического строения гемицеллюлоз. Оптимальные условия действия цитолитических ферментов: рН  4,5-5,0, температура 35- 40 °С.

Гидролиз некрахмальных полисахаридов в консервной промышленности необходим для снижения вязкости соков[9].  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.3.1. Целлюлолитические микроорганизмы и ферменты

В природе имеются так называемые целлюлолитические микроорганизмы, содержащие набор ферментов — целлюлаз, способных к расщеплению не только аморфной, но и кристаллической целлюлозы до глюкозы. Попадая на поверхность целлюлозосодержащего материала и прикрепляясь к ней, микроорганизм выделяет целлюлазы, под действием которых субстрат  целлюлаза в непосредственной близости от грибка-паразита расщепляется до конечного продукта — глюкозы. Микроорганизм поглощает глюкозу в качестве основного продукта питания, размножается, растет, захватывая все большие участки поверхности, выбрасывает все новые и новые порции ферментов, пока не истощится доступная целлюлоза. 
Однако эти процессы протекают весьма медленно. Для того чтобы пень в лесу полностью сгнил, нужны годы. Если же отделить от микроорганизма ферменты целлюлазы, сконцентрировать их и добавить к целлюлозе, процесс значительно ускорится. При этом образующаяся глюкоза не потребляется грибками, а накапливается в реакционной смеси. Кроме того, если в качестве субстрата использовать не чистую целлюлозу, а целлюлозосодержащие отходы промышленности или сельского хозяйства, то можно решить и еще одну важную проблему — утилизацию отходов. Полученная глюкоза в зависимости от ее чистоты и экономической эффективности процесса может найти применение в медицине, пищевой промышленности, тонкой химической технологии или технической микробиологии. Глюкозу, как известно, можно сбраживать в этанол и затем употреблять как «жидкое топливо» в качестве заменителя части нефтепродуктов.  
Целлюлоза на нашей планете — самое «крупнотоннажное» из всех возобновляемых видов сырья. Если даже малую долю этих отходов превращать ферментативным путем в полезные продукты, это даст ощутимый (и возобновляемый!) источник пищевых углеводов и заменителей нефти. Поэтому данной проблемой в последние годы столь упорно занимаются и исследователи, и технологи всего мира[13].

2. Гидролиз белков

Ферментативный гидролиз белков происходит под действием протеолитических ферментов (протеаз). Они классифицируются на эндо- и экзо-пептидазы. Ферменты не имеют строгой субстратной специфичности и действуют на все денатурированные и многие нативные белки, расщепляя в них пептидные связи  -СО-NH-[18].

Эндопептидазы (протеиназы) – гидролизуют непосредственно белок по внутренним пептидным связям. В результате образуется  большое количество полипептидов и мало свободных аминокислот.

Оптимальные условия действия кислых протеиназ: рН 4,5-5,0, температура 45-50 °С .

Экзопептидазы (пептидазы) действуют, главным образом, на полипептиды и пептиды, разрывая пептидную связь с конца. Основные продукты гидролиза - аминокислоты. Данную группу ферментов делят на амино-, карбокси-, дипептидазы.

Аминопептидазы катализируют гидролиз пептидной связи, находящейся рядом со свободной  аминогруппой.

                   R                      R1

H2N - СН - С - - NH - СН - С ....

       

                             О                           

Карбоксипептидазы  осуществляют гидролиз пептидной связи, находящейся рядом со свободной карбоксильной группой.

                       СООН

СО -NH- С – Н

                                 R

 

Дипептизады катализируют  гидролитическое расщепление дипептидов на свободные аминокислоты. Дипептидазы расщепляют только такие пептидные связи, по соседству с которыми находятся одновременно свободные карбоксильная и аминная группы.

 

                                                  дипептидаза

NH2CH2CONHCH2COOH + Н2О              2CH2NH2COOH

Глицин-глицин                                             Гликокол

 

Оптимальные условия действия: рН 7-8, температура 40-50 оС. Исключение составляет карбоксипептидаза, проявляющая максимальную активность при температуре 50 оС и рН 5,2.

Гидролиз белковых веществ в консервной промышленности необходим при производстве осветленных соков[7].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.1.Преимущества ферментативного  способа получения белковых гидролизатов

При производстве биологически активных веществ из белоксодержащего сырья наиболее важным является его глубокая переработка, предусматривающая расщепление белковых молекул до составляющих мономеров. Перспективным в этом отношении является гидролиз белкового сырья с целью производства белковых гидролизатов - продуктов, содержащих ценные биологически активные соединения: полипептиды и свободные аминокислоты. В качестве сырья для производства белковых гидролизатов могут быть использованы любые полноценные по аминокислотному составу природные белки, источниками которых являются кровь и ее составные компоненты; ткани и органы животных и растений; отходы молочной и пищевой промышленности; ветеринарные конфискаты; пищевые и малоценные в пищевом отношении продукты, получаемые при переработке различных видов животных, птицы, рыбы; отходы производства мясокомбинатов и клеевых заводов и др. При получении белковых гидролизатов для медицинских и ветеринарных целей служат, в основном, белки животного происхождения: крови, мышечной ткани и внутренних органов, белковые оболочки, а также белки молочной сыворотки[15].

Проблема гидролиза белков и ее практическая реализация с давних пор привлекают внимание исследователей. На основе гидролиза белков получают различные препараты, широко применяемые в практике: как кровезаменители и для парентерального питания в медицине; для компенсации белкового дефицита, повышения резистентности и улучшения развития молодняка животных в ветеринарии; как источник аминокислот и пептидов для бактериальных и культуральных питательных сред в биотехнологии; в пищевой промышленности, парфюмерии. Качество и свойства белковых гидролизатов, предназначенных для различного применения, обусловлены исходным сырьем, способом гидролиза и последующей обработкой полученного продукта.

Варьирование способов получения белковых гидролизатов позволяет получать продукты с заданными свойствами. В зависимости от содержания аминокислот и наличия полипептидов в диапазоне соответствующей молекулярной массы может быть определена область наиболее эффективного использования гидролизатов. К белковым гидролизатам, получаемым для различных целей, предъявляются разные требования, зависящие в первую очередь от состава гидролизата. Так, в медицине желательно применение гидролизатов, содержащих 15...20% свободных аминокислот; в ветеринарной практике для повышения естественной резистентности молодняка преимущественным является содержание в гидролизатах пептидов (70...80%); для пищевых целей важными являются органолептические свойства получаемых продуктов. Но основным требованием при использовании белковых гидролизатов в различных областях является сбалансированность по аминокислотному составу[19].

Гидролиз белка можно осуществить тремя путями: действием щелочей, кислот и протеолитических ферментов. При щелочном гидролизе белков образуются остатки лантионина и лизиноаланина, которые являются токсичными для организма человека и животных. При таком гидролизе разрушаются аргинин, лизин и цистин, поэтому для получения гидролизатов его практически не используют. Кислотный гидролиз белка является широко распространенным способом. Чаще всего белок гидролизуют серной или соляной кислотой. В зависимости от концентрации используемой кислоты и температуры гидролиза время процесса может изменяться от 3 до 24-х часов. Гидролиз серной кислотой проводят 3...5 часов при температуре 100...130 оС и давлении 2...3 атмосферы; соляной - в течение 5...24 ч при температуре кипения раствора под небольшим давлением.

При кислотном гидролизе достигается большая глубина расщепления белка и исключается возможность бактериального загрязнения гидролизата. Это особенно важно в медицине, где гидролизаты применяются, в основном, парентерально и необходимо исключить анафилактогенность, пирогенность и другие нежелательные последствия. В медицинской практике широко применяются кислотные гидролизаты: аминокровин, гидролизин Л-103, ЦОЛИПК, инфузамин, геммос и другие.

Недостатком кислотного гидролиза является полное разрушение триптофана, частичное оксиаминокислот (серина и треонина), дезаминирование амидных связей аспарагина и глутамина с образованием аммиачного азота, разрушение витаминов, а также образование гуминовых веществ, отделение которых затруднительно. Кроме того, при нейтрализации кислотных гидролизатов образуется большое количество солей: хлоридов или сульфатов. Последние являются особенно токсичными для организма. Поэтому кислотные гидролизаты нуждаются в последующей очистке, для чего в производстве обычно используется ионообменная хроматография[3].

Во избежание разрушения лабильных аминокислот в процессе получения кислотных гидролизатов, некоторые исследователи использовали мягкие режимы гидролиза в атмосфере инертного газа, а также добавляли к реакционной смеси антиоксиданты, тиоспирты или производные индола. Кислотный и щелочной гидролиз имеют, кроме указанных, еще существенные ограничения, связанные с реактивностью среды, что приводит к быстрой коррозии оборудования и вызывает необходимость соблюдения жестких требований техники безопасности для операторов. Таким образом, технология кислотного гидролиза достаточно трудоемка и требует использования сложной аппаратуры (ионообменные колонки, ультрамембраны и т.п.) и дополнительных этапов очистки получаемых препаратов.

Проведены исследования по разработке электрохимической ферментативной технологии получения гидролизатов. Использование этой технологии позволяет исключить из процесса применение кислот и щелочей, т. к. рН среды обеспечивается в результате электролиза обрабатываемой среды, содержащей незначительное количество соли. Это, в свою очередь, позволяет автоматизировать процесс и обеспечить более тонкий и оперативный контроль технологических параметров[16].

Как известно, в организме белок под действием пищеварительных ферментов расщепляется до пептидов и аминокислот. Аналогичное расщепление можно провести и вне организма. Для этого к белковому веществу (субстрату) добавляют ткань поджелудочной железы, слизистую оболочку желудка или кишечника, чистые ферменты (пепсин, трипсин, химотрипсин) или ферментные препараты микробного синтеза. Такой способ расщепления белка называется ферментативным, а полученный гидролизат - ферментативным гидролизатом. Ферментативный способ гидролиза является более предпочтительным, по сравнению с химическими методами, т. к. проводится в "мягких" условиях (при температуре 35...50оС и атмосферном давлении). Преимуществом ферментативного гидролиза является то обстоятельство, что во время его проведения аминокислоты практически не разрушаются и не вступают в дополнительные реакции (рацемизация и другие). При этом образуется сложная смесь продуктов распада белков с различной молекулярной массой, соотношение которых зависит от свойств применяемого фермента, используемого сырья и условий проведения процесса. Полученные гидролизаты содержат 10...15% общего азота и 3,0...6,0% аминного азота. Технология его проведения относительно проста.