Иммобилизованные ферменты. Методы иммобилизации

1. Иммобилизованныеферменты. Методы  иммобилизации 

ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ ФЕРМЕНТЫ(от лат. immobiiis — неподвижный), препараты ферментов, молекулы к-рых связаныс матрицей, или носителем (как правило, полимером), сохраняя при этом полностьюили частично свои каталитич. св-ва. Иммобилизованные ферменты обычно не раств.в воде; между двумя фазами возможен обмен молекулами субстрата, продуктовкаталитич. р-ции, ингибиторов и активаторов.

Коммерческоеиспользование ферментов ограничено рядом факторов. Важнейшие из них — нестабильность ферментов и их высокая стоимость. Стоимость можно существенноснизить за счет иммобилизации фермента. Это означает, что фермент закрепляют наповерхности или внутри твердой подложки, которую легко удаляют из реакционнойсмеси после завершения ферментации. Фермент может быть использован повторно,что существенно снижает стоимость процесса.

Другое преимуществоиммобилизации заключается в том, что фермент становится более стабильным,вероятно, за счет ограничения его способности денатурировать при изменениях рН,температуры и растворителей. К примеру, иммобилизованная глюкозоизомеразастабильна при 65°С в течение года, тогда как в растворе она денатурирует при 45°С за несколько часов.

Иммобилизованныйфермент можно использовать для непрерывного (открытого) производства, пропускаяреагенты через фермент и собирая продукт на конечном этапе.

Методы иммобилизацииферментов

Существуют различныеспособы иммобилизации ферментов. Они включают либо механическое включение(захват) фермента, либо его присоединение к определенной структуре, илиматрице. Преимуществом метода захвата является то, что фермент сохраняется вестественном состоянии. Однако крупным молекулам трудно добраться до фермента.

Физическая иммобилизацияферментов представляет собой включение фермента в такую среду, в которой длянего доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физическойиммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существуетчетыре типа связывания ферментов:

— адсорбция нанерастворимых носителях;

— включение в порыгеля;

— пространственноеотделение фермента от остального объема реакционной системы с помощьюполупроницаемой перегородки (мембраны);

— включение вдвухфазную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной изфаз.

Для иммобилизацииферментов в геле существует два основных способа. При одном из них ферментпомещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, врезультате чего образуется полимерный гель с включенными в него молекуламифермента. В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные(содержащие в молекуле две двойные связи) сшивающие агенты, которые придаютобразующемуся полимеру структуру трехмерной сетки. В другом случае ферментвносят в раствор готового полимера, который затем каким-либо образом переводятв гелеобразное состояние. Способ иммобилизации ферментов путем включения вполимерный гель позволяет создавать препараты любой геометрическойконфигурации, обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора вобъеме носителя. Метод универсален, применим для иммобилизации практическилюбых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и клеток. Фермент,включенный в гель, стабилен, надежно защищен от инактивации вследствиебактериального заражения, так как крупные клетки бактерий не могут проникнуть вмелкопористую полимерную матрицу. В то же время, эта матрица может создаватьзначительные препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическуюэффективность иммобилизованного препарата, поэтому для высокомолекулярныхсубстратов данный метод иммобилизации не применим вообще.

Захват шарикамиальгината легко продемонстрировать на лабораторных занятиях; он являетсянаиболее распространенным промышленным методом. Раствор, содержащий фермент иальгинат натрия, по каплям вносят в раствор хлористого кальция. Как толькокапельки вступают в контакт с хлористым натрием, они немедленно начинаютпревращаться в гель; при этом образуются идеальные по форме шарики геля,содержащие внутри захваченный фермент. Для длительного использования гель можностабилизировать полиакриламидом или приготовить его в виде пластин, еслипоместить его на тканевую основу.

Главным отличительнымпризнаком химических методов иммобилизации является то, что путем химическоговзаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентныесвязи, в частности между белком и носителем. Препараты иммобилизованныхферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайнеймере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента сносителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При широкомварьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется сносителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Этоособенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, атакже для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитическихсистемах. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить ксущественным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность,каталитическая активность и стабильность.

2.Применение иммобилизованных  ферментов

Лучшим примеромпроцесса, в котором успешно используются иммобилизованные ферменты, являетсяпроизводство кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы. Он широкоиспользуется в США и Японии в качестве подсластителя, например, во фруктовыхнапитках, так как он значительно дешевле сахарозы. Сироп готовят из относительнодешевого источника углеводов — крахмала, получаемого из кочерыжек кукурузныхпочатков. Процесс осуществляется с участием трех ферментов. Сначала получаюткрахмальную массу путем перемалывания (растирания) кукурузы, затем две амилазыпревращают крахмал в глкжозный сироп. Обесцвеченный и сконцентрированный сиропдобавляют в различные пищевые продукты и напитки. С помощью ферментаглкжозоизомеразы можно превратить этот сироп в смесь, содержащую равныеколичества глюкозы и фруктозы. Для этого сироп пропускают через колонку, вкоторой содержится фермент, иммобилизованный путем адсорбции на целлюлозномионообменнике. Активность фермента со временем постепенно снижается, поэтомуобычно используют несколько колонок, работающих одновременно. Фруктоза слащеглюкозы, хотя обе содержат одинаковое число калорий на единицу массы. Этоозначает, что, используя кукурузный сироп с высоким содержанием фруктозы, можнополучить такой же сладкий продукт как с глюкозой, но с меньшим количествомкалорий. Ежегодно в США производится около 4 млн. тонн сиропа.

Первым иммобилизованнымферментом, примененным в промышленном масштабе, была аминоацилаза. Она былаиспользована в Японии в 1969 г. для производства аминокислот, добавляемых вкорм животных. На мировом рынке эта продукция пользуется большим спросом.

Каждая молекулааминокислоты может существовать в двух формах, одна из которых являетсязеркальным отображением другой, как правая и левая рука. Эти две формыназываются оптическими изомерами и являются право- и левовращающими формами,или D- и L-формами (по направлению вращения ими плоскости поляризации света).Все существующие в природе аминокислоты являются L-аминокислотами. Гораздолегче получить аминокислоты путем химического синтеза, чем выделять их изклеток, однако синтезированные аминокислоты образуются в виде смеси равныхколичеств D- и L-изомеров. Проблема получения L- аминокислот решается с помощьюферментов, специфически катализирующих превращения только одной из форм.Основные стадии процесса представлены в виде диаграммы на рисунке.

Фермент иммобилизуютпутем ионного связывания на колонке с носителем. После непрерывнойавтоматизированной работы в течение 30 дней при 50°С активность ферментаснижается до 40%; для восстановления активности добавляют свежий фермент. Врезультате благодаря иммобилизации экономится 40% фермента.

Другой примериспользования иммобилизованных ферментов — производство полусинтетическихпенициллинов из природных пенициллинов. Иммобилизованный фермент химическимодифицирует одну из боковых групп молекулы пенициллина, что приводит кповышению антибиотической активности пенициллинов.