Исследование реакций восстановления метилфеофорбида а

Рисунок 6. Формилирование по Вильсмейеру Fe(III)-хлорина е₆ т.м.э.

 
При формилировании Fe(III)-изохлорина е₄ д.м.э. (12) образуется только продукт реакции по винильной группе .

Рисунок 7. Формилирование по Вильсмейеру

При действии формилирующей смеси  на Cu(II)-метилмезопирофеофорбид (а) происходит замена гидроксила енольной формы на хлор с последующим формилированием енольной формы .

Реакция производных хлорофилла и  комплекса Вильсмейера с N,N-диметиламиноакролеином проходит по 20-положению хлоринового цикла, даже если в молекуле исходного соединения есть карбонильная и винильная группа. При действии этого комплекса на Ni (II) 9-дезоксо-метилмезопирофеофорбид (а) (13) [17] или комплекса Ni (II) мезохлорина е₆ т.м.э. (14) дает 20-формилвинильное производное (выходы 80% и 75% соответственно). В случае комплексов Ni (II) метилмезопирофеофорбида (а) (15) и метилпирофеофорбида (а) (16) замещение идет также в 20-положение (выходы 83% и 63%) .

 

Рисунок 8. Синтез формил-винильных производных по Вильсмееру.

 Цианирование комплекса Cu (II) метилмезопирофеофорбида (а) проводилось при помощи бромциана в хлороформе в присутствии хлорида олова и суспендированного карбоната калия. Реакция обычно заканчивается через 7-9 часов с выходом 40-50% после деметаллирования.

Рис. 9. Цианирование Cu (II) метилмезопирофеофорбида (а)

 Действием на Cu (II) метилмезопирофеофорбид (а) хлорметилметилсульфида в присутствии хлорида титана в сухом хлористом метилене при 40^оС было получено 20-СН₂SCH₃ производное с выходом 74-77% после ПТСХ.

Рис. 10. Получение 20-СН₂SCH₃ Cu (II) метилмезопирофеофорбида (а)

 

1.4 Реакции нуклеофильного замещения  при карбонильном атоме углерода  в положении 13(1) форбиновых производных  хлорофилла

В связи с тем, что атом углерода карбонильной группы в положении 13 (1) доступен для нуклеофильной атаки  и имеется возможность делокализации  отрицательного заряда на атоме углерода в положении 13 (2) за счет сопряжения с хлориновым циклом и карбметоксильной группой, для форбиновых производных хлорофилла возможны реакции раскрытия экзоцикла V при действии нуклеофилов по схеме :

Рис. 11 Схема реакции нуклеофильного раскрытия экзоцикла V

Например, действием на феофорбиды (а) (2) и (b) (4) щелочью (КОН) в метаноле получают хлорин е₆ (7) и родин g₇ (9) . Обработкой феофорбидов (а) и (b) диазометаном получают триметиловые эфиры соответствующих хлоринов (7) и (9) . По-видимому, и в том и в другом случае нуклеофилом, раскрывающим экзоцикл, является метилат-анион. Это подтверждается результатами работы, в которой т.м.э. хлорина е₆ (8) и родина g₇ (10) получают из соответствующих метилфеофорбидов действием раствора метилата калия в метаноле с пиридином. В работе такая же реакция проведена в более жестких условиях. Смесь т.м.э. хлорина е₆ (8) и родина g₇ (10) получают действием метилата натрия на смесь метилфеофорбидов (а) (3) и (b) (6) в сухом метаноле с ТГФ под азотом и затем смесь разделяют колоночной хроматографией на оксиде алюминия.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рисунок 12 Форбиновые производные хлорофилла

1. феофитин (а): R₁=CH₃, R₂=Phyt, R₃=H, R₄=CO₂CH₃
2. феофорбид (а): R₁=CH₃, R₂=H, R₃=H, R₄=CO₂CH₃
3. метилфеофорбид (a): R₁=R₂=CH₃, R₃=H, R₄=CO₂CH₃

(4) феофитин (b): R₁ = CH=O, R₂ = Phyt, R₃ = H, R₄ = CO₂CH₃

(5) феофорбид (b): R₁ = CH=O, R₂ = H, R₃ = H, R₄ = CO₂CH₃

(6) метилфеофорбид (b): R₁ = CH=O, R₂ = CH₃, R₃ = H,

                                           R₄ = CO₂CH₃

 

 

 

 

 

Рис.13 Производные хлорофилла (7) хлорин е6: R1 = R2 = R3 = H, R4 = CH3 (8) т.м.э. хлорин е6: R1 = R2 = R3 = CH3, R4 = CH3 (9) родин g7: R1=R2=R3=H, R4 = CH=O (10) т.м.э. родин g7: R1 = R2 = R3 = CH3, R4 = CH=O

Аналогичное раскрытие цикла V происходит при действии аминов (см. рис. 14):

Рисунок 14. Механизм реакции раскрытия экзоцикла V с аминами

При действии на метилфеофорбид (а) (3) метиламина и этиламина в ТГФ при комнатной температуре получают с хорошим выходом соответствующие амиды. В реакцию вступают все форбиновые производные хлорофилла, содержащие фрагмент ß-кетокислоты. Сравнение реакционной способности в этой реакции феофитинов (а) и (b) и соответствующих хлорофиллов, то есть магниевых комплексов, показывает, что комплекс более реакционно способен в этой реакции .

Зависимость скорости размыкания экзоцикла  от природы металла, координированного с H₂ХЛ, оказывается сложной . Центральные атомы ведут себя существенно различно: Mg, Cd благоприятствуют расщеплению, Zn и Co несколько замедляют его, Ni практически не изменяет скорости, Hg сильно тормозит ее. Скорости размыкания для Mg²⁺, Cd²⁺, Co²⁺ и Hg²⁺ линейно зависят от электроотрицательности металлов. Zn²⁺  и  Ni²⁺ не укладываются на прямую.

 

 

 

1.5 Положение сигналов спектров ЯМР ¹Н метилфеофорбида (а)

Таблица 1 Положение сигналов спектров ЯМР ¹Н метилфеофорбида а (литературные данные)

 

Отнесение	Метилфеофорбид (а) Лит - ые данные
10 – Н	9.48 с 1Н
5 – Н	9.33 с 1Н
20 – Н	8.58 с 1Н
3(1) – Н	7.97 дд (1Н, 18.4 и 11.5Гц)
3(2) - Н транс	6.27 дд (1Н, 17.8 и 1.4Гц)
3(2) - Н цис	6.17 дд (1Н, 12.8 и 1.4Гц)
13(2) – R	R= H 6.28 с 1Н
18 – Н	4.48 м 1Н
17-Н	4.22 м 1Н
13(4) - СН3	3.91 с 3Н
12(1) - СН3	3.65 с 3Н
8(1)	3.69 м 2Н
17(4) - СН3	3.59 с 3Н
2(1) - СН3	3.40 с 3Н
7(1) - СН3	3.19 с 3Н
17(1) –СН2	2.39 – 2.20 м 4Н
17(2) – СН2
18(1)	1.84  д (3Н, 7.2Гц)
8(2)	1.68 т (3Н, 7.6Гц)
I – NH	0.52 уш.с 1Н
III – NH	-1.58 уш.с 1Н

 

2 Экспериментальная часть

2.1 Приборы и реактивы

Для получения  производных хлорофилла в качестве сырья использовали высушенные листья спирулины, которые предварительно подвергали механическому измельчению.

Для проведения колоночной и тонкослойной хроматографии использовали четыреххлористый углерод марки “ч”, ацетон марки “ч”. Для приготовления элюентов соотношение растворителей брали по объему. При проведении колоночной хроматографии, колонку наполняли “мокрым способом”, используя четыреххлористый углерод.

Для экстракции производных хлорофилла из спирулины использовали этанол марки “ч” без дополнительной очистки.

Для получения  метилфеофорбидов использовали метанол  марки “ч” без дополнительной очистки.

Для осаждения феофитинов использовали разбавленную соляную кислоту квалификации “ч” в соотношении 1:10 (по объему).

При получении  метилфеофорбидов использовали концентрированную  серную кислоту марки “ч”.

Для переосаждения  из хлороформа выделенных соединений использовали пентан, квалификации “ч” без дополнительной очистки.

Безводный сульфат натрия, квалификации “х.ч.” использовали для удаления остатков воды из растворов.

Колоночную  хроматографию проводили на силикагеле L 100/400.

 

2.2 Получение феофитинов из спирулины

50 г сухой измельченной спирулины экстрагировали в 1 дм³ этанола. Хорошо перемешивали и ставили в тёмное место. Полученный экстракт упаривали примерно до 50мл. Затем подкисляли соляной кислотой (9 Н₂О:1 НСl). Спирт после ротора заново заливали для дальнейшего экстрагирования. Через несколько дней выпавшие феофетины отфильтровывали. Отмывали небольшим количеством воды для нейтрализации кислоты (проверяли с помощью индикаторной бумажки), затем спиртом до обесцвечивания раствора. Феофитины на фильтре оставляли сушиться на воздухе. (Раствор после промывания выливать не следует, оставляли для дальнейшего выпадения феофитинов). Экстрагирование  проводили 4 раза. Получали 0,7 г феофитинов.

2.3 Получение метилфеофорбида(а)  из феофитинов

Высушенные  0,7 г  феофитинов  растворяли в смеси 34 см³ метанола и 1,4 см³ концентрированной серной кислоты. Смесь кипятили в течение 60 минут с обратным холодильником.  Далее в остывшую реакционную смесь прилили 70 см³ дистиллированной  воды. Выпавший в осадок метилфеофорбид (а) отфильтровали и отмыли водой  до рН промывных вод (от метанола и серной кислоты). Растворили  метилфеофорбид (а) на фильтрах в 50 см³ хлороформе высушили над безводным сульфатом натрия. Раствор упаривали досуха на роторе. Полученную смесь метилфеофорбидов разделяли колоночной хроматографией на силикагеле с изменением соотношения компонентов элюирующей системы (ССI₄ : ацетон) от 80:1 до 50:1. За ходом разделения следили при помощи TCX (Silufol, СС1₄ : ацетон - 4:1). Фракцию, содержащую основное вещество, упарили и получили метилфеофорбид (а).

 

2.4 Хроматографическое исследование  соединений

Метод ТСХ. Контроль за процессами выделения, разделения и превращениями производных хлорофилла при помощи ТСХ проводили на пластинках Silufol и Sorbifol. В качестве элюентов использовали смеси ССI₄ с ацетоном в соотношениях 4:1 (по обьему).

Для сравнения хроматографической подвижности в условиях тонкослойной хроматографии использовали метод свидетеля. Для этого исследуемая смесь и эталонный образец хроматографировали на одной и той же пластинке, совпадения значений R_f при близких концентрациях исследуемого пигмента и “свидетеля” означает хроматографическую идентичность этих соединений в данной хроматографической системе.

 

3 Обсуждение результатов

3.1 Получение метилфеофорбида  (а)

Получение метилфеофорбида а из спирулины через феофитины см. Рисунок 15.

Рисунок 15. Схема получения метилфеофорбида а

Для получения метилфеофорбида а сухую спирулину экстрагировали настаиванием с этанолом и полученный этанольный экстракт подкисляли разбавленной соляной кислотой (7%). Феофитины в отличие от хлорофиллов плохо растворимы в этаноле. Поэтому, когда при подкислении густого этанольного экстракта спирулины соляной кислотой, происходит удаление магния из координационной сферы хлорофиллов, образующиеся феофитины выпадают в осадок. Считается, что, поскольку кислота добавляется в относительно небольшом количестве, другие вещества осаждаются с феофитинами незначительно. Далее экстракт подкисляли соляной кислотой и выпавшие при этом в осадок феофитины обрабатывали метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты. Превращения хлорофиллов, происходящие при этом, можно представить следующим образом  (см. 16)

Рисунок 16 Получение метилфеофорбида а из хлорофиллов

(где С₂₀H₃₉ – фрагмент спирта фитола, этерифицирующего фитилпропионатный заместитель хлорофиллов высших растений).

Колоночной  хроматографией и кристаллизацией  был выделен метилфеофорбид а массой 70 мг. Строение полученного соединения подтверждено данными ПМР- и ИК-спектроскопии (приложение А, приложение Б).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выводы

1. Проведен анализ литературы по реакциям восстановления метилфеофорбида а.
2. Отработана методика выделения производных хлорофилла а из спирулины.
3. Методом колоночной хроматографии выделен метилфеофорбид а. Структура полученного соединения подтверждена методом ИК- и ЯМР-спектроскопии.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

 

1  Kenner G. V., Mac Combie S. W., Smith K. M. Pyrrols end related compounds. Part XXIV. Separation and oxidative degradation of chlorophyll derivatives. // J. Chem. Soc. Percin Trans 1 (1973) p. 2517-2523.

2 Smith K. M., Bushell M.J., Rimmer J, Unsworth J.F. Bacteriochlorophylls (c) from Chloropseudomonas etilenium. Comparation and NMR studies of the pheophorbides and derivatives.// J. Chem. Soc. (1980) v 102, p. 2437-2448

3  Seely G. R.  The structure and chemistry of functional groups. In “The chlorophylls” //ed. By L. P. Seely and C.R.  Vernon ,N-Y., Acad. Press (1966) p. 67-108

4  Миронов А. Ф. Разработка  сенсибилизаторов второго поколения  на основе природных хлорофиллов. // Росс. Хим. Журн. (1998) №5, с. 23-26

5  Mironov A. N., Efremov A. V., Efremova O. A., Bonnet R. Novel chlorines with δ-lacton ring.// Mendeleev Commun. (1997) p. 244-245

6  Abraham R.J., Rowan A.E., Smith N.N., Smith K. M. NMR spectra of the porphyrins. Part 42. The synthesis and aggregation behavior of some chlorophylls analogous. // J. Chem. Soc. Perkin Trans 2 (1993) p. 1047-1059

7  Osuka A., Wada U., Shinoda S. Covalently linked pyropheophorbide dimmers as model of thr special pair in the photosynthetic reaction center. // Tetragedron (19960 v. 52 ., № 12, p. 4311-4326

8  Fuscher R., Engel N., Henseleler A., Gossauer A. Synthesis of chlorophyll (a) labeled at C(3²) from pheophorbide (a) methyl ester. // Helv. Chem. Acta (1994) v. 77, p. 1046-1050

9   Smith K. M., Bisset J. M.F., Bushell M.J. partial synthesis of optically pure methyl bacteriopheophorbides (c) and (D) from  methyl pheophorbides (a). // J. Org. Chem.(19800 v. 45, p. 2218-2224

10 Tamiaki H., Miyatake T., Tanicaga R. Self-aggregation of  synthetic zinc chlorines possessing “invers” keto-hydroxyl groups.// Tetragedron Lett. (1997) voll. 38, № 2, p. 267-270.

11  Mettath S., Shibata M., Alderfer J. L., Seng M.O., Smith K. M., Rein R., Dougherty T.J., Pandey R.K. Synthesis and spectroscopic properties of novel benzochlorines derived from chlorophyll (a).// J. Org. Chem. (1998) v. 63 , p. 1646-1656.

12. Бажанова, Н.В., Маслова, Т.Г., Попова, И.А., Попова, О.Ф., Сапожников, Д.И., Эйдельман, З.М. При участии Черноморского, С.М. и Меницкой, Я.М. Пигменты пластид зеленых растений и методика их исследования. – М.-Л.: Наука, 1964. – 120 с.
13. Порфирины: структура, свойства, синтез. / Под ред. Н.С. Ениколопяна – М.: Наука, 1985. – 334 с.

14  Wasielewski M.R., Johnson D.J., Neimczuc M.P., Gaines G.l., O’Neil M.P., Svec W.A.  Chlorophyll-porphyrin heterodimers with orthogonal π-systems: solvents polarity dependent  photophysics.// J.Am. Chem. Soc. (1990) v. 112, p. 6482-6488.

15  Tamiaki H., Kouba M. Synthesis of chlorophyll (a) homologos by Wittig and Knoevenagel reaction with methyl  pyropheophorbide (d).// Tetragedron (1997) v. 53, №31, p. 10677-10688.

16 Ломова Т. Н.  Основы синтеза и механизмы химических превращений порфиринов и их аналогов. Часть 1,2 Текст лекций. Иваново 2007, с.78.

17  Smith K. M., Goff  D.A., Simpson D. J. Mesosubstitution of  chlorophyll derivatives: direct rote for transformation  of  bacteriopheophorbides (d) into bacteriopheophorbides (c).// J. Am. Chem. Soc. (1985) v. 107, p. 7946-4954

 

 

 

ПРИЛОЖЕНИЕ  А

Положение и мультиплетность сигналов спектров ПМР  метилфеофорбида а

Отнесение сигналов	Метилфеофорбид а (литературные данные)
10-Н	9,48 (с 1Н)
5-Н	9,33 (с 1Н)
20-Н	8,58 (с 1Н)
3(1)-Н	7,97 (д д, 1Н, 18,4 и 11,5 Гц)
3(2)-Н (транс)	6,27 (дд 1Н, 17,8 и  1,4 Гц)
3(2)-Н (цис)	6,17 (дд 1Н, 12,8 и  1,4 Гц )
13(2)-СН2	6,28 (с 2Н)
18-Н	4,48 (м 1Н)
17-Н	4,22 (м 1Н)
13(4)- СН3	3,91 (с 3Н)
12(1)-СН3	3,65 (с 3Н)
17(4)-СН3	3,59 (с 3Н)
2(1)-СН3	3,40 (с 3Н)
7(1)-СН3	3,19 (с 3Н)
8(1)-СН2	3,61 (кв 2Н, 8,1 Гц)
17(1),17(2)-СН2	2,39-2,20 (м 4Н)
18(1)-СН3	1,84 (д 3Н, 7,2 Гц)
8(2)-СН3	1,68 (т 3H, 7,6 Гц)
I-NH	-
III-NH	-