Этапы иммуноблоттинга

     ВПГ-2: выделенный гликопротеин G2. 

     Интерпретация результатов: реактивность к одной из инфекций определяется как соответствующая темная линия на стрипе. 

6. Диагностика антител класса IgМ/IgG к вирусу Эпштейна-Барра  методом иммуноблоттинга  с возможностью определения  стадии инфекции

     Иммуноблот, позволяющий качественно определить наличие в сыворотке или плазме крови человека IgМ-антитела и/или IgG-антитела к антигенам вируса Эпштейна-Барра.

     Антигены: Источником антигенов для тестов Anti-EBV WESTERNBLOT (EUROIMMUN, Германия) является полный экстракт антигенов вируса Эпштейна-Барра (штамм P3HR1). Белки вирусного экстракта были разделены по молекулярной массе методом прерывистого электрофореза в полиакриламидном геле и эти белки были перенесены на нитроцеллюлозную мембрану блотовых стрипов. Нанесенные на стрипе вестерн-блота антигены:

Рис. 7. Стрип для диагностики  ВЭБ-инфекции с нанесенными  на него антигенами

Результаты  постановки реакции с набором Anti-EBV WESTERNBLOT можно разделить на отрицательные, неопределенные и положительные:  

Результат	Характеристика
CA
Отрицательный	Отсутствуют положительные  полосы CA.
Неопределенный	По крайней  мере одна положительная полоса CA средней  интенсивности.
Положительный	По крайней  мере одна положительная полоса CA сильной  интенсивности.
EA
Отрицательный	Отсутствуют положительные  полосы EA.
Неопределенный	По крайней  мере одна положительная полоса EA средней  интенсивности.
Положительный	По крайней  мере одна положительная полоса EA сильной  интенсивности.
NA
Отрицательный	Отрицательная полоса NA.
Неопределенный	Положительная полоса NA средней интенсивности.
Положительный	Положительная полоса NA сильной интенсивности.

 

Статус  инфекции	Результат теста Anti-EBV WESTERNBLOT
Отсутствие	Отсутствуют  полосы специфических антигенов  или они дают только очень  слабые сигналы.
Первичная инфекция	Присутствует, по крайней мере, одна положительная  полоса CA сильной интенсивности  в тестах на IgG-антитела и IgM-антитела.  Замечание:  Приблизительно в 5% случаев антитела  класса IgM к антигену CA не образуются. Исследования с образцами клинически  охарактеризованных сывороток показали, что в этих случаях при первичной  инфекции могут выявляться антитела  класса IgG к CA в сочетании с  антителами класса IgM к NA и р27.
Поздняя фаза инфекции	Присутствует  полоса NA и, по крайней мере, одна  положительная полоса VCA сильной  интенсивности в тесте на IgG-антитела.  Замечание:  Приблизительно в 5% случаев антитела  класса IgG к антигену NA не образуются  или титр этих антител падает. Исследования с образцами клинически  охарактеризованных сывороток показали, что в этих случаях на поздней  стадии инфекции могут выявляться  антитела класса IgG к полосе р22 CA.
Реактивация	Присутствует  положительная полоса NA в тесте  на IgG-антитела и, по крайней  мере, одна сильная полоса CA в  тесте на IgG-антитела или, по  крайней мере, одна сильная полоса  ЕA в тесте на IgG-антитела или,  по крайней мере, одна сильная  полоса CA в тесте на IgМ-антитела.  Полоса NA в  тесте на IgG-антитела отрицательная  и присутствует, по крайней мере, одна сильная полоса CA в тесте  на IgG-антитела при отрицательных  полосах CA в тесте на IgМ-антитела  и, по крайней мере, одной сильной  полосе ЕA в тесте на IgG-антитела.  Следующее  сочетание полос может отражать  как реактивацию, так и первичную  инфекцию с отсутствием антител  к BA: полоса NA отрицательная и,  по крайней мере одна сильная  полоса CA положительная в тесте  на IgG-антитела; отрицательны полосы  антигенов ЕА и CA в тесте  на IgМ-антитела.

Таблица 8. Интерпретация  результатов по статусу  инфекции

Схема 2.  Диагностики ВЭБ-инфекции

7. Диагностика антител класса IgG к вирусу гепатита С методом иммуноблоттинга

 

     Иммуноблот, позволяющий качественно определить наличие в сыворотке или плазме крови человека IgG-антитела против вируса гепатита С. Используется для подтверждения  положительных результатов, полученных при скрининговых исследованиях.

     Антигены: для теста RecomBlot HCV IgG 2.0 (MIKROGEN, Германия) используются очищенные рекомбинантно созданные антигены.

     Интенсивность линий на стрипах пациентов сравнивается с контрольным стрипом.  

      

Линии	Интенсивность
Отрицательная	-
Слабо-положительная (видимая, но слабее чем core-антиген слабо-положительного контроля)	+/-
Интенсивность хорошо различимая (такая же интенсивность  как у core-антигена слабо-положительного контроля)	+
Сильная интенсивность (более сильная, чем  у core-антигена слабо-положительного контроля)	++

Таблица 9. Оценка интенсивности  линий

     Результат исследования получается прибавлением значений отдельных линий, которые  определяются как +/-, + или ++.

Сумма линий	Оценка
0-5 6-9 >9	Негативный  Пограничный Положительный

Таблица 10. Интерпретация результатов исследования

     Пациенты  с пограничными результатами должны быть повторно обследованиы после 3-4 недель. Если при этом результаты с изолированными реакциями против NS-антигенов не показывают каких-либо изменений, то это  может быть вызвано перекрестной реактивностью. Так же это может  указывать на остаточный титр после  инфекции или на неспецифическую  реакцию с рекомбинантными антигенами.

     Для подтверждения положительных результатов  исследования рекомендуется ПЦР  для определения генома HCV.

     Отрицательные результаты исследования не исключают  вирусную инфекцию. HCV-антитела могу не обнаруживаться у гемодиализных  пациентов, несмотря на положительные  результаты ПЦР-методом.

3. Правила забора биоматериала для исследования на иммуноблоте

 

• Материалом  для исследования является венозная кровь, которая берется из локтевой вены.
• Используется обычная сухая пробирка или вакуумная пробирка с красной крышкой. Возможен забор крови в вакуумную пробирку с фиолетовой или с синей крышкой.
• Количество забираемой крови: для исследования на одном стрипе необходимо забрать 1,5-2 мл крови.
• Кровь пациента до передачи курьеру должна храниться в холодильнике (+2 - +4?С) или в контейнере с хладогеном.
• Пробирки с кровью отдаются курьеру вместе с направлениями. Номера пробирок должны соответствовать номерам на направлениях.
•   Кровь отправляется в лабораторию в день забора. До следующего дня цельную кровь хранить нельзя!
• Если невозможно кровь пациента передать в лабораторию в день забора, то необходимо отделить сыворотку от форменных элементов крови. Для этого необходимо: центрифугировать кровь после образования сгустка при 1000 об/мин в течение 10 минут, затем отобрать сыворотку в одноразовую пластиковую пробирку типа eppendorf (1,5 мл). Отобранную сыворотку хранить в холодильнике можно в течение 1-2 дней.

 

 

Рис. 8. Форма направления  на исследования методом  иммуноблота 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Заключение 

     В конце хотелось бы отметить, что иммуноблоттинг является одним из современных имунноаналитических методов, который позволяет достаточно качественно и что очень важно, быстро определить возбудителей достаточно распространённых в последнее время  инфекционных заболеваниях. И очень наглядным примером является определение с помощью этого метода ВИЧ-инфекции, которая на данное время является глобальной медицинской проблемой.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Список  литературы 

1. Ройт А. “Основы иммунологии” Мир 1990 г.
2. В.Г. Галактинов “Графические модели в иммунологии” Медицина 1986г.
3. Р.В. Петров “Иммунология” Медицина 1987 г.
4. А.М. Егоров “Теория и практика иммуноферментного анализа” Высшая школа  1991 г.
5. Каталог фирмы BIORAD 1996 г.
6. Материалы занятий и лекции по микробиологии 1995 - 1996 год.
7. М.В. Маркина, В. В. Романов «Практическое руководство по интерпретации полученных результатов»