Мікотоксини в харчових продуктах

 

 

 

 

 

 

 

 

4.Нормативно-правова база по визначенню мікотоксинів в харчових продуктах харчування:

• ДСТУ EN 12955-2001 (Продукты пищевые. Определение афлатоксина-В1 и суммы афлатоксинов В1, В2, G1 и G2 в зерновых культурах, фруктах с твердой кожурой и производных от них продуктах. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с помощью постколоночной дериватизации и очистки на иммунной колонке (EN 12955:1999, IDT)

• ДСТУ EN ISO 15141-1-2001 (Продукты пищевые. Определение содержания охратоксина А в зерне и зерновых продуктах. Часть 1. Метод жидкостной хроматографии высокого разрешения и очисткой силикагелем (EN ISO 15141-1:1998, IDT)

• ДСТУ EN ISO 15141-2-2001 (ДСТУ EN ISO 15141-2-2001  Продукты пищевые. Определение содержания охратоксина А в зерне и зерновых продуктах. Часть 2. Метод жидкостной хроматографии высокого разрешения с очисткой бикарбонатом (EN ISO 15141-2:1998, IDT)

• МУ 4082-86 (Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания афлатоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии)

• ГОСТ Р 52471-2005 (Корма. Иммуноферментный метод определения микотоксинов)

• ГОСТ Р 53162-2008 (Продукты пищевые. Определение афлатоксина B1 и общего содержания афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии)

• ГОСТ 30711-2001(Продукты пищевые. Методы выявления и определения содержания афлатоксинов В1 и М1)

• ГОСТ Р 53162-2008 (Продукты пищевые. Определение афлатоксина B1 и общего содержания афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии)

• МУ 5177-90 (указания по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) и зеараленона в зерне и зернопродуктах)

Таким чином, основними методами визначення мікотоксинів в харчових продуктах є імуно-ферментний та метод ВЕРХ.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5.Кількісний аналіз мікотоксинів

Метод високоефективної  рідинної  хроматографії.

Молочні продукти

Пробопідготовка складається з етапів відбору проби; осадження білка шляхом первинної екстракції мікотоксинів розчином NaCl і лимонної кислоти при нагріванні і подальшої екстракції хлороформом в конічній колбі; центрифугування; перенесення вмісту пробірок (без білкового осаду) в ділильну воронку, додаткової промивки білкових осадів хлороформом і перенесення хлороформних шарів в ділильну воронку, упарювання відокремленого хлороформного шару на роторному випарнику, додавання точних об’ємів дистильованої води і гексану, поділу водного та гексанового шарів в ділильній воронці, відділення водного шару, повторного додавання до водного шару гексану, поділу шарів у ділильної воронці; наступного очищення та концентрування водного шару (знежиреного водного екстракту) з добавкою 5% ацетонітрилу методом твердофазної екстракції, елюювання , віддування елюента до заданого обсягу при температурі не вище 50 ° С.

Хлібобулочні  вироби, мука,зерно.

Тверді вироби (макарони, сушки, сухарі) попередньо подрібнюють у блендері до стану гомогенної маси.

Кондитерські вироби (торти, тістечка), хліб і хлібобулочні вироби (булки) для забезпечення однорідності проби та видалення надлишкової вологи змішують з натрієм сірчанокислим в співвідношенні 1:3 (за масою) і гомогенізують в блендері до стану гомогенної маси.

Проби муки (різних сортів) і пряностей у вигляді порошку (перець, кориця) не вимагають попереднього подрібнення.

Пробу продукту (подрібнену, гомогенізований) екстрагують ацетонітрилом, екстракт фільтрують через фільтруючу насадку PTFE (0.45 мкм, d = 30 мм) за допомогою одноразового шприца, до фільтрату доливають заданий обсяг дистильованої води, отриману емульсію піддають очищенню за допомогою твердофазної екстракції на картриджах Strata C18 -E, зібраний з картриджа елюатів віддувають до заданого обсягу. До сконцентрованого після віддування елюату додають розчину йоду і залишають на 20 хв при кімнатній температурі.

 

Горіхи

Подрібнену (гомогенізовану) пробу продукту екстрагують хлористим метиленом, використовуючи УЗ-ванну, в колбі з поліетіеновой пробкою. Колбу з екстрактом поміщають в холодильній камеру (температура +5 ° С) для осадження твердих частинок. Після осадження твердого шару верхній шар декантирують в пробірки і центрифугують. Верхній шар з центріфужнихсклянки пробірок фільтрують в мірний скляний циліндр з допомогою пластикового одноразового шприца через ущільнену в шприці пробку з фільтрувального паперу. Фільтрат віддувають до заданого обсягу, доливають заданий обсяг гексану, вміст циліндра перемішують за допомогою УЗ-ванни. Отриманий розчин піддають очищенню за допомогою твердофазної екстракції. Зібраний елюат залишають при кімнатній температурі на час не менше ніж 20 хв.

Загальні  підходи до пробо підготовки при  визначенні мікотоксинів в харчових продуктах:

• екстракція мікотоксину  з проби органічним розчинником;
• очищення та концентрування екстракту;
• підготовка проби для введення в хроматограф.

Далі аналіз в більшості  випадків проводять з використанням  вфлуориметричного детектора методом зовнішнього стандарту.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Імуно-ферментні методи в аналізі мікотоксинів

Імуноферментний метод оснований на вимірюванні вмісту мікотоксинів в пробах за допомогою непрямого твердо фазного конкурентного ІФА робочих розчинів екстрактів (рис.5)

Непрямий ІФА заснований на здатності мікотоксинів взаємодіяти зі специфічними антитілами в умовах конкуренції з білковим кон’югатом мікотоксину,нанесеним на поверхню комірок планшету, - твердо фазним агентом.

Аналітичний сигнал (значення оптичної густини), що відображає ступінь  взаємодії між антитілом і  антигеном, обернено пропорційний концентрації мікотоксину в розчині

 

 

 

Рис.5. Основні етапи імуноферментного визначення мікотоксинів

 

 

 

6.Якіний аналіз мікотоксинів

Для якісної ідентифікації  мікотоксинів може бути використана тонкошарова хроматтограія а також ІФА.

При якісній ідентифікації  методом ТШХ пластинку для ТШХ ("Силуфол") розмічають тонкими олівцевими лініями. На горизонтальну лінію,  наносять за допомогою мікрошприця робочі розчини мікотоксинів. На відстані 1 см від плям наносять розчини стандартів розчину стандарту. Пластинку поміщають в камеру для ТШХ з сумішшю ефір-метанол-вода (94:4,5:1,5). Пластинку витягають з камери, сушать на повітрі 5 хв. І  розглядають в довгохвильовому УФ-світлі. Виявлення на пластинці плям, відповідних по хроматографічної рухливості і кольором флуоресценції плямам стандартів, свідчить про можливу наявність мікотоксинів в пробі.

Якісний аналіз іммуно-ферментним методом проводиться аналогічно кількісному визначенню. На останній стадії проводиться візуальне порівняння стандартних і досліджуваних розчинів.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7.Особливості аналізу мікотоксинів в Україні:

• діючі стандарти регламентують вміст не всіх мікотоксинів (наприклад, не регламентується і не визначається вміст фумонізін, фузапроліферіна та деяких інших токсинів).
• значна маса сільгосппродукції реалізується через ринки або в формі оплати праці (наприклад, зерном часто оплачується оренда земельних паїв). Ця продукція не проходить необхідних перевірок.
• в домашньому господарстві плісняві продукти зазвичай не знищуються видаляється їх частина, що має чіткі ознаки цвілі, а зовні нормальні використовуються для приготування їжі, хоча вони можуть містити і, як правило, містять мікотоксини.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Висновок: мікотоксини – розповсюджена група токсикантів не техногенного походження, що утворюються внаслідок діяльность мікроорганізмів. Мають виражену гостру та хронічну токсичність. Небезпеку становить є також недостатня інформованість споживачів про шкоду мікотоксинів і особливості ураження ними харчових продуктів.

Основними методами кількісного  визначення мікотоксинів є

Метод ВЕРХ та імуноферментні методи. Для якісної ідентифікації мікотоксинів  

Застосовують методи тонкошарової хроматографії а також імуноферментні методи

Діюча нормативно-правова  база по визначенню мікотоксинів в Україні не є досконалою і потребує вдосконалення.

 

 

 

 

 

 

 

 

Список використаної літератури

1. Артюх В. П., Гойстер О. С., Хмельницький Г. О., Стародуб М. Ф. Трихотециновые микотоксины: природа, биотрансформация, биологические эффекты // Современные проблемы токсикологии. —2002.— № 4.
2. Bennett W., Klich M. Mycotoxins // Clinical Microbiology Review.— 2003.— V. 16, № 3.— Р. 497-516
3. Smith, J. E.; Moss, M. O// Formation, analysis and significance. -2003.-148 р
4. Hussein S. Hussein , Jeffrey M. Brasel// Toxicity, metabolism, and impact of mycotoxins on humans and animals.-2001.- Toxicology 167. – Р. 101–134.
5. Krogh, P.  Mycotoxins in food. -1987.-  263pp.
6. J. Chem. Soc., Chem. Commun// Structure elucidation of the fumonisins, mycotoxins from Fusarium moniliforme.- J. Chem. Soc., Chem. Commun.,-1988-Р. 743-745

7. Eric W. Sydenham, Pieter G. Thiel, Walter F. O. Marasas, Gordon S. Shephard, Dirk J. Van Schalkwyk, Klaus R. Koch// Natural occurrence of some Fusarium mycotoxins in corn from low and high esophageal cancer prevalence areas of the Transkei, Southern Africa.- 1990- J. Agric. Food Chem., , 38 (10), Р. 1900–1903

8. http://www.mycotoxins.info
9. http://www.prochrom.ru
10. http://ru.wikipedia.org