Применение липосом в медицине

Мы предлагаем включать лекарства в липидный бислой липосом в виде липидных производных – липофильных пролекарств, которые расщепляются внутриклеточными ферментами с высвобождением исходного препарата. Такой подход упрощает технологию получения лекарственных липосом и делает ее универсальной. Более того, по сравнению с инкапсулированием в водный объем липосом, включение в бислой позволяет улучшить фармакологические свойства системы доставки в целом, благодаря уменьшению потерь лекарства как в кровотоке, так и при взаимодействии липосомы с клеткой. Очевидно также, что липидные производные способны к прямому трансмембранному переносу, что кардинально меняет механизм эндоцитоза и внутриклеточного трафика препарата и облегчает разгрузку липосом. Для сравнения, чтобы обеспечить выход лекарства из водного объема Stealth-липосом после их попадания в эндосомы клетки-мишени, предлагается использовать рН-чувствительные молекулярные триггеры, в том числе пептидные, фосфолипидные и др. Низкая эффективность внутриклеточной разгрузки, обусловленная жесткостью липидного бислоя (температура его фазового перехода превышает 60°С) и затрудненным слиянием с клеточными мембранами – один из существенных недостатков Stealth-липосом.

Нами разработаны синтезы липидных производных широко применяемых в клинике химиотерапевтических средств: мелфалана (и его рацемата сарколизина) и метотрексата. Цитотоксик мелфалан – алкилирующий агент, действующий независимо от стадии клеточного цикла, – применяется в химиотерапии почти 50 лет. Цитостатик метотрексат, антиметаболит фолиевой кислоты, также давно используется для лечения онкологических и аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, где он по-прежнему остается «лекарством номер один». Связь между лекарством и остальной частью молекулы пролекарства должна легко гидролизоваться внутри клетки. Поскольку эстеразы обладают меньшей специфичностью, чем амидазы, и широко представлены во всех органах и тканях, предпочтительна сложноэфирная связь, а не амидная. Кроме того, при разработке молекулярных структур липидных конъюгатов учитывалось их наилучшее соответствие упаковке липидного бислоя липосом (рис. 1).

Рис. 3. Молекулярные структуры липидных конъюгатов лекарств и схематическое изображение лекарственной липосомы

Липосомы с пролекарствами формируются стандартным методом экструзии: липидные пленки, полученные из смеси всех амфифильных компонентов (яичный фосфатидилхолин, фосфатидилинозит из пекарских дрожжей и пролекарства), подвергаются гидратации буферным физраствором, затем 5-6 циклам замораживания (жидкий азот) – оттаивания и наконец, 10-20-кратной экструзии при температуре не выше +40°С через поликарбонатные мембранные фильтры с размерами пор 100 нм. Для экструзии мы используем установку фирмы Lipex (Канада) при давлении азота до 50 ат или ручной экструдер Avanti (США), в зависимости от количества требуемых препаратов. На рис. 2 приведены электронные микрофотографии дисперсий липосом, полученные методом замораживания-скалывания, который наиболее адекватно отражает размеры и структуру исходных липосом в водной фазе.

Рис. 4. Электронные микрофотографии реплик с поверхностей скола замороженных дисперсий липосом, нагруженных: А, а – липидным конъюгатом метотрексата; Б, б – липидным конъюгатом мелфалана

Очевидно, что липосомы, содержащие до 10 мол. % липофильных пролекарств, действительно представляют собой моноламеллярные везикулы диаметром до 100 нм. Известно, что фосфатидилинозит стабилизирует мембрану липосом, подобно остаткам полимера в Stealth-липосомах. Мы полагаем, что этот природный фосфолипид не должен вызывать нежелательные побочные эффекты, которые сопутствуют повторному применению липосом с полиэтиленгликолем.

Физико-химическая стабильность липосом исследована нами с помощью динамического лазерного светорассеяния, электронной микроскопии и гель-хроматографии в сочетании со спектрофотометрическим анализом на хромофоры лекарств и липидный фосфор. Показано, что пролекарства полностью (нагрузка липидного бислоя до 10 мол. %) встраиваются в мембрану липосом и образуют стабильные дисперсии, содержащие лекарственное начало в концентрациях, пригодных для системного введения животным. Такие дисперсии можно хранить несколько дней при +4 °С. Однако сами лекарства, в особенности остаток мелфалана, в водной среде подвергаются постепенной деградации. Для длительного хранения дисперсии можно замораживать при –196 °С и хранить при температурах ниже –20 °C; перед применением их необходимо разморозить и кратковременно обработать на ультразвуковой бане. Действительно, агрегаты липосом, образовавшиеся после размораживания дисперсий (рис. 3,б), диспергируются с восстановлением исходных наноразмерных липосом (рис. 3,в).

Рис. 5. Электронные микрофотографии липосом с липофильным пролекарством мелфалана (метод негативного контрастирования):

а – через 20 ч после получения; б – после размораживания замороженных в жидком азоте дисперсий; в – после обработки размороженных дисперсий на ультразвуковой бане

Состав липосом при этом также сохраняется: липофильнеые пролекарства не выделяются из липидного бислоя липосом в отдельные агрегаты. Таким образом, глубокое замораживание без криопротекторов может быть одним из способов длительного хранения липосомальных препаратов с липидными конъюгатами мелфалана и метотрексата.

Другой вопрос: какова стабильность сложноэфирных связей липофильных пролекарств после внутривенного введения липосомальных дисперсий? На примере конъюгата метотрексата нами показано, что пролекарства в составе липосом устойчивы к преждевременному гидролизу эстеразами плазмы крови человека. Действительно, высокоэффективная жидкостная хроматография со спектрофотометрическим детектированием продемонстрировала стабильность пролекарства метотрексата при инкубации in vitro в плазме крови вплоть до 24 ч. Очевидно, липосомы защищают сложноэфирные конъюгаты от действия внеклеточных эстераз.

Проведена первая серия экспериментов по изучению фармакокинетики липосомального конъюгата метотрексата. В РОНЦ РАМН разработан и широко применяется в клинике метод анализа фармакокинетики метотрексата и продукта его метаболизма 7-гидроксиметотрексата с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Исследования, проведенные нами на контрольной группе мышей СВАхC57Bl/6(F1), показали, что фармакокинетика метотрексата при его внутривенном введении в эквивалентной дозе (10 мг/кг) значительно отличается от таковой для конъюгата метотрексата в липосомах. Отметим, что методика проведения хроматографического анализа конъюгата метотрексата до конца не разработана и должна быть оптимизирована. Тем не менее уже первые результаты показывают перспективность липосомального препарата. Приведем некоторые данные. Период полувыведения конъюгата метотрексата, соответствующий быстрой фазе распределения по органам и тканям, в девять раз выше, чем интактного метотрексата (3,6 против 0,4 мин). Период полувыведения из плазмы конъюгата превышает почти в 3,5 раза показатель для исходного лекарства (40 мин против 12). Последующее образование собственно метотрексата из пролекарства происходит гораздо более замедленно, в результате период его полувыведения значительно увеличивается и составляет 196 мин по сравнению с 12 мин при введении интактного лекарства. Таким образом, липосомальный препарат является пролонгированной формой метотрексата. Приведенные результаты могут свидетельствовать о более высоком терапевтическом потенциале новой лекарственной формы метотрексата в виде диглицеридного конъюгата, заключенного в липосомы, при таких системных гематологических заболеваниях, как злокачественные лейкозы и лимфомы. Доказательством этому предположению служит тот факт, что при введении липосомального препарата величина экспозиционной дозы в сыворотке крови по метотрексату превышала более чем в два раза таковую после введения самого лекарства в эквивалентной дозе.

Терапевтическая эффективность липосом с липофильными пролекарствами показана нами in vivo на моделях рака молочных желез и лимфолейкозов. Увеличение продолжительности жизни мышей c перевитым лейкозом Р-388 при лечении липосомальным препаратом диглицеридного конъюгата сарколизина возросло в 1,5 раза, по сравнению с лечением интактным лекарством, а при лечении мышей BLRB c перевитым раком молочных желез этот показатель увеличился в два раза. Недавно нами проведено кратковременное лечение острого Т-лимфолейкоза мышей метотрексатом и липосомальными препаратами конъюгата метотрексата. Эта модель лимфолейкоза проявляет сходство с Т-клеточными лимфомами человека, которые очень агрессивны и трудно поддаются химиотерапевтическому лечению. Тем не менее даже в режиме умеренной терапии липосомы с конъюгатом метотрексата показали улучшение выживания по сравнению с исходным лекарством почти на 10 %. Необходимы дальнейшие исследования для оптимизации режимов лечения (дозы, число инъекций и т.д.) и исследования фармакокинетики и биораспределения лекарственных липосом, которые уже зарекомендовали себя как перспективную систему доставки для наномедицины.

2.6 Иммуносомы-разновидность липосом

Оригинальным направлением в липосомологии явилась разработка нового поколения лекарственных препаратов – иммунолипосом. Иммунолипосомы представляют собой липосомы, к которым прикреплены моноклональные антитела (МКА). МКА обеспечивают специфическое связывание липосом с антигенпозитивными клетками, а липосомы несут соответствующий гидрофобный или гидрофильный химиотерапевтический препарат.

В настоящее время различают три типа иммунолипосом: А, В и C. В иммунолипосомах типа А МКА ковалентно связаны с обычными липосомами посредством короткого якоря. Тип B – это уже пегилированные липосомы, в которых МКА также ковалентно связаны с ними посредством короткого якоря. Тип С (Pendant-type PEG-immunoliposomes) – это стерически стабилизированные ПЭГ липосомы, в которых МКА прикреплены к дистальному терминальному концу ПЭГ.

С помощью липосом типа А было убедительно продемонстрировано, что иммунолипосомы более эффективно доставляют лекарства в клетки-мишени по сравнению с обычными липосомами в тестах как in vitro, так и in vivo. Однако связывание иммунолипосом с клетками-мишенями in vivo было более сложным. Изучение иммунолипосом in vivo показало, что прикрепление к липосомам антител усиливало их захват мононуклеарами РЭС. Эффективность связывания иммунолипосом с клетками-мишенями зависела от плотности антител на поверхности липосом. Захват иммунолипосом клетками РЭС и эндотелиальный барьер, разделяющий сосудистое русло от опухолевой ткани, побудили исследователей к созданию нового типа липосом. Это привело к конструированию стерически стабилизированных иммунолипосом, с удлиненным периодом циркуляции в крови.

В первых работах по созданию долгоциркулируюших иммунолипосом к стерически стабилизированным липосомам, содержащим фосфолипиды с модифицированными ПЭГ головными группами, антитела были прикреплены через короткий гидрофильный якорь близко к поверхности липосом (липосомы типа B). Эти липосомы сохраняли свойство долговременной циркуляции, но взаимодействие с клетками-мишенями было угнетено по тому же механизму, как и угнетение захвата мононуклеарами РЭС, т.е. из-за блокады ПЭГ.

Позже МКА были прикреплены к дистальным концам цепей ПЭГ, связанным с липосомами (липосомы типа С). Это привело к сохранению способности стерически стабилизированных липосом специфически связываться с клеточной поверхностью клеток-мишеней и быть защищенными от захвата мононуклеарами РЭС.

липосома транспортный частица лечение терапия

Сравнение эффективности специфического связывания и захвата мононуклеарами РЭС этих трех типов иммунолипосом, проведенное K. Maruyama на модели МКА 34А против поверхностного эпителия легких, показало, что 42,5% липосом типа А накапливаются в легких, а в крови и печени выявляется небольшое количество. При введении липосом типа С специфически связываются 56,6% от введенной дозы липосом. В крови и печени накапливалось меньше препарата (7%), чем при инъекции липосом типа А. Липосомы типа B показали низкий уровень специфического связывания и около 60% препарата от введенной дозы долго циркулировало в крови. Таким образом, наиболее перспективными являются липосомы типа С.

В настоящее время для ковалентного прикрепления МКА к терминальным концам ПЭГ, с целью получения стабильной связи антител с ПЭГ, используют три метода, т.е. связывание через серу (thiother), амидные группировки (amide) и гидразоны (hidrazone).

К антителам, используемым в конструировании иммунолипосом, предъявляют определенные требования. МКА должны сохранить свою специфичность при конъюгации с липосомами, иметь афинность, достаточную для связывания низкой концентрации иммунолипосом, обладать низкой иммуногенностью. С этой целью используют гуманизированные МКА, для удаления мышиного белка, а также Fab' фрагменты антител для удаления фрагментов Fc. Антитела должны эффективно интернализовываться клетками-мишенями путем эндоцитоза, обладать биологической активностью и усиливать противоопухолевый ответ. МКА должны быть технологичны в производстве и иметь достаточный срок хранения.

К антигену, являющемуся мишенью для иммунолипосом, также имеются определенные требования. Он должен сильно и гомогенно экспрессироваться в опухолевой ткани, быть жизненно важным для опухолевой клетки и не исчезать с клеточной поверхности. Антиген должен минимально слущиваться с поверхности опухолевой клетки для избежания связывания иммунолипосом с растворимым антигеном или усиления клиренса. Комплекс антиген–иммунолипосома должен пиницитироваться в опухолевую клетку.

Связь антител с липосомами должна быть стабильной в крови. Якорь не должен связываться с распознающим местом на молекуле антител и быть иммуногенен, должен быть нетоксичен и избегать опсонизации, не должен влиять на препарат в липосоме, стабильность липосомной мембраны и оказывать стерическое препятствие.

Эффективное связывание иммунолипосом с клетками-мишенями происходит лишь тогда, когда мишени находятся в сосудистом пространстве или когда иммунолипосомы проходят сквозь слабую сосудистую стенку. В литературе рассматриваются два анатомических подхода. Первый – это уже существующие внутрисосудистые места, такие как поверхностный эндотелий сосудов, клетки крови или тромбы. Второй – менее доступные места, такие как солидные опухоли, места инфекции или воспаления, в которых сосудистые структуры слабы. Доказано, что капиллярная проницаемость эндотелиального барьера во вновь васкулиризируемых опухолях значительно выше, чем в нормальных тканях. Нормальные ткани выстланы нефенестрированным сосудистым эндотелием, и прохождение макромолекул или липосом в ткань затруднено. Кроме того, в опухолевой ткани практически отсутствует дренирование лимфатической системой, поэтому макромолекулы и липосомы накапливаются в опухолевой ткани и остаются там длительное время. Несколькими методами в различных опухолевых моделях на мышах было убедительно доказано, что липосомы диаметром 100–200 нм проходят через сосудистую стенку и накапливаются в опухолевой ткани.