Техніко-економічне обґрунтування виробництва лимонної кислоти

Рис. 9. Технологічна схема  отримання лимонної кислоти при  глибинної ферментації продуцента: 1 - ємність з меласою, 2 - приймач меляси, 3 - ваги, 4 - варильний котел, 5 - відцентровий насос, 6 - проміжна ємність, 7 - стерилізуюча колонка, 8 - видержива-тель ,9 - холодильник, 10 - посівної апарат, 11 - головний ферментатор, 12 - стерилизующие фільтри, 13 - ємність для зберігання меляси, 14 - проміжний збірник, 15 - барабанний вакуум-фільтр, 16 - приймач для міцелію, 17 - вакуум- збірник для міцелію, 18 - вакуум-збірник фільтрату культуральної рідини.

Порівняння глибинного та поверхневого способу ферментації

При однаковій потужності заводів капітальні витрати на будівництво  будівель ферментаційних цехів приблизно  в два рази більше при поверхневому способі ферментації головним чином  через спорудження камер. Вартість же обладнання для нього, навпаки, в 1,3-1,5 рази менше і велика частина його виготовляється на місці. Загальні одноразові витрати на будівлі та обладнання для глибинного способу на 20-30% менше при більшій величині швидко зношувального обладнання.     Витрати на електроенергію при глибинному способі ферментації в кілька разів вище. Енергія витрачається в основному на отримання стисненого повітря. При поверхневому способі ферментації повітря подається під дуже невеликим тиском і витрата його менше. Витрати на обслуговуючий персонал дещо більше при поверхневому способі, так як підготовка камер і зняття міцелію з кювет вимагають великих затрат ручної праці.            Собівартість лимонної кислоти дещо нижче при поверхневому способі ферментації. Цей спосіб має й інші переваги: ​​вища концентрація лимонної кислоти в культуральній рідині, значно менше утворюється побічних кислот, внаслідок чого витрачається менше меляси при ферментації і менше втрати при хімічній переробці культуральних рідин. При поверхневому способі гриб менш чутливий до перерв в аерації. Обслуговування та контроль процесу ферментації прості, проблеми виникають тільки при необхідності підтримки вимагається температури повітря в камері при високій температурі зовнішнього повітря (в районах з жарким літом).    Глибинний спосіб дозволяє переробляти широкий набір цукровмісної сировини, він не так вимогливий до якості меляси, що на загальному тлі його погіршення є важливим гідністю. Швидкість ферментації за цим способом вище, в одному апараті відразу виходить велика кількість культуральної рідини і вона не збирається по численних кюветам, що спрощує технологію. Ферментація ведеться в стерильних умовах, що є необхідною передумовою для переходу на безперервний, повністю механізований процес, що усуває ручну працю.            Якщо поверхневий спосіб вичерпав свої потенційні можливості, застарів, то глибинний відповідає всім вимогам сучасної біотехнології знаходиться в стадії розвитку. Освоєння безперервної ферментації підвищить продуктивність і економічність процесу. У вітчизняній промисловості, що виробляє лимонну кислоту, нові заводи будуються тільки для роботи з глибинного способу ферментації, а існуючі заводи з поверхневим способом ферментації поступово переводяться на глибинний. 

2. Характеристика біологічного  об’єкту та біологічна схема виробництва лимонної кислоти

2.1 Біохімія процесу утворення лимонної кислоти

Біосинтез лимонної кислоти  здійснюється за допомогою культури А. niger, спеціально селекціонованої для отримання високих виходів продукту. Як субстрат використовують мелясу, яка крім вуглеводів, містить великий ряд органічних кислот. Застосування певного живильного середовища з сахарозою призводить до меншого якісного розмаїття кислот (лимонна, щавлева і глюконова кислота).       Біохімічний механізм утворення лимонної кислоти заснований на функціонуванні циклу трикарбонових кислот. Дегідріровання оцтової кислоти призводить до утворення двох молекул СО₂ і чотирьох пар іонів водню. У циклі відбувається також утворення НАДН і АТФ. Хоча більшість реакцій циклу оборотні, основним напрямком течії ензиматичних реакцій є утворення щавелевоуксусной кислоти через α-кетоглутаровую, янтарну і фумарову кислоти.          Реакцією, лімітуючої швидкість обороту циклу, є синтез лимонної кислоти, що каталізується аллостеріческім ферментом цітратсінтетази. Джерелом ацетил-КоА, який йде на синтез метаболітів циклу, є продукт циклу - лимонна кислота - легко переходить в цитоплазму через мембрану. Як правило, з ЦТК на потреби біосинтезу йде значна кількість метаболітів, і поповнення їх фонду та функціонування повного циклу в клітинах існують додаткові компенсуючі ферментативні механізми, наприклад гліоксилатний шунт. В останньому, на відміну від ЦТК, оцтова кислота витрачається на синтез. Отже, першою реакцією ЦТК є конденсація ацетил-КоА з щавелевоуксусной кислотою, каталізуюча цитратсинтетази. Саме активність цього ферменту є контролюючим параметром, що визначає швидкість метаболічного потоку в циклі. Інгібуючий ефект на цитратсинтетазу надає НАДН і сукциніл-КоА. Але основний вплив на швидкість синтезу лимонної кислоти справляє надходження субстрату (щавелевоуксусної кислоти). Так як безперервна «робота» ЦТК вимагає реокиснення відновлених еквівалентів (використовуються 4 пари дегідрогеназ), максимальна швидкість циклу спостерігається в умовах достатнього доступу кисню в клітинну систему (тобто при гарній аерації).        Аерація має критичне значення для глибинної ферментації. Пропущення чистого О₂ збільшує утворення лимонної кислоти, але це дорого; газова фаза може циркулювати, якщо при цьому поглинається СО₂. Переривання аерації на короткий час може мати згубну дію на продукцію лимонної кислоти, але якщо при цьому підвищити рН з 3,0 до 4,0, то ферментація може розпочатися знову.       У грибів розрізняють трофофазу, яка характеризується зростанням міцелію і активним диханням з виділенням СО₂, та ідіофазу (продукційну фазу), коли зростання завершене, дихання придушене, а залишена глюкоза переробляється у вторинні метаболіти; в даному випадку в лимонну або інші кислоти.           Утворення лимонної кислоти може бути умовно поділено на три процеси: 1 - розкладання гексоз до пірувату і ацетил-КоА при гліколізі, 2 – анаплеротічне утворення оксалоацетата з пірувату і СО₂ і 3 - акумуляція цитрату в ЦТК. А. niger розкладає глюкозу по гексозодіфосфатному (80%) і гексозомонофосфатного шляху.        При роботі першого шляху СО₂, утворена в результаті декарбоксилювання пірувату, фіксується при анаплеротичному утворенні оксалоацетату. (При роботі гексозомонофосфатного шляху СО2 не фіксуються). Поряд з гліколізом у A. niger частково реалізується і інший шлях окислення вуглеводів - пентозофосфатний, званий також пентозним, гексозомонофосфатного, або фосфоглюконатним. Загальним з гліколізом вихідним продуктом є глюкозо-6-фосфат, але надалі їх шляхи розходяться: фермент фосфофруктокіназа визначає дихотомічний шлях, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа - апотомічний. Кінцевими продуктами процесу є 3-фосфогліцериновий альдегід і рибоза-5-фосфат. Перший з них по реакціях гліколізу перетворюється на піровиноградну кислоту, тому пентозофосфатний цикл розглядається як шунт гліколітичного шляху. Основне призначення циклу - постачання клітини НАДН2, необхідної для відновних реакцій синтезу ліпідів і стероїдів, і пентози, в основному рибозой, яка використовується в синтезі нуклеотидів і нуклеїнових кислот.  Гексозомонофосфатний шлях і гліколіз мають багато спільних ферментів. Таким чином, обидва шляхи можуть реалізовуватися в клітці одночасно. При перетворенні 6 молекул глюкозо-6-фосфату по гексозомонофосфатному шляху сумарний ефект буде той же, що і при окисленні 1 молекули гексози в СО₂ по шляху гліколізу і ЦТК.   У процесі розкладання глюкози утворюються проміжні сполуки: маніт, арабіт, єрітріт, гліцерин.        Утворення лимонної кислоти тісно пов'язане зі швидкістю фіксації СО₂. Фіксацію СО₂ у А. niger здійснює конститутивний фермент піруваткарбоксілази. Існують майже стехиометрическое відношення між фіксацією СО₂ і продукцією цитрату.         Фермент аконітаза, що бере участь у розщепленні цитрату в ЦТК, знижує його продукцію. Вважали, що при дефіциті Fe або при додаванні Cu відбувається інгібування аконітази і відповідно збільшення виходу цитрату. Однак аконітаза каталізує реакцію, сильно зрушену в бік утворення цитрату, і необхідності в її інгібуванні немає. Інший фермент - НАДФН-залежна ізоцитратдегідрогеназа, яка теоретично повинна сприяти зниженню акумуляції лимонної кислоти, інгібується цитратом. Правда, у А. niger є ще один аллостерічно НАД-зв'язаний фермент - ізоцитратдегідрогеназа, яка активується цитратом.           Вихід лимонної кислоти залежить від активності α-кетоглутаратдегидрогенази. Утворення сукцініл-КоА з α-кетоглутарата під дією α-кетоглутаратдегидрогенази називають вузьким місцем ЦТК. Фермент інгібується фізіологічною концентрацією щавелевоуксусної кислоти і НАДН. Збільшення клітинного оксалоацетата знижує катаболізм цитрату на рівні α-кетоглутарата і одночасно посилює швидкість його синтезу за участю цітратсінтази. Акумуляція α-кетоглутарата і НАДН знижує активність НАД (НАДФ)-ізоцітратдегідогенази, що сприяє збільшенню накопичення цитрату до рівня, при якому сам інгібує вищевказаний фермент.    Цитрат сильно пригнічує транспорт глюкози в клітці шляхом придушення активності фосфофруктокенази. Останньому протидіє збільшення концентрації NH4 +, а накопиченню NH4 + сприяє дефіцит Mn в середовищі. Вважають, що при дефіциті Mn посилюється розкладання білків і внутрішньоклітинний вміст NH4 + зростає. Підвищення концентрації амонійних іонів всередині клітин пом'якшує інгібуючий вплив цитрату на фосфофруктокінази.         Більшість дослідників схиляється до думки, що основну роль грає інгібування ферментів - аконітатгідратази і ізоцитратдегідрогенази. Інгібування аконітатгідратази пояснюють дією самої лимонної кислоти або надлишку гексаціаноферроата калію, вживаного для обробки мелассного середовища перед ферментацією.         При інтенсивному кислотоутворенні активність цитратсинтетази зростає приблизно вдесятеро. Однак за наявними даними ще не можна вирішити питання, що є причиною накопичення лимонної кислоти - інгібування зазначених двох ферментів або активування цитратсинтетази.

Біохімічна схема синтезу  лимонної кислоти     Відомо, що до другої доби ферментації в середовищі, вже покритої тонкою міцеліальної плівкою, у відчутних кількостях містяться янтарна і яблучна кислоти, а також не пов'язані з ЦТК кислоти: глюконова, цукрова і малонова. Перші дві кислоти утворюються безпосереднім окисленням глюкози, малонова як проміжний продукт на шляху синтезу насичених жирних кислот. Зміст цих кислот зростає до третьої-п'ятої доби ферментації. Таким чином, інгібування аконітатгідратази і ізоцитратдегідрогенази починають викликати перераховані вище кислоти, що викликає поступове накопичення лимонної кислоти, яка в свою чергу ще більше інгібує дані ферменти, і підсилює їх синтез.         Слід звернути увагу ще на одного можливого учасника в цьому механізмі - малонову кислоту, що є специфічним інгібітором сукцинатдегідрогенази. Малонова кислота утворюється більше інших кислот і вміст її в середовищі зростає до четвертих-п'ятих діб - часу початку найбільш інтенсивного продуцирування лимонної кислоти.    У період інтенсивного накопичення лимонної кислоти в ЦТК переважає анаплеротичний шлях метаболізму, тобто спочатку відбувається карбоксилювання піровиноградної кислоти з утворенням щавелевоуксусной, а потім конденсація її з ацетил-КоА. Інтенсивність утворення лимонної кислоти в цей період може бути зрозуміла також з того, що в даному випадку різко обмежуються можливості конструктивного і енергетичного обміну речовин клітини і A.niger для підтримки життєздатності змушений переробляти значно більшу кількість субстрату.    Фактором, що стимулює акумуляцію лимонної кислоти, служить аерація. О₂ необхідний і для реокиснення гліколітичного НАДН в процесі лимоннокислої ферментації.

2.2 характеристика біологічного  об’єкту та біологічна схема  виробництва лимонної кислоти