Тонкослойная хроматография

Оглавление

 

1. Планарная  (тонкослойная) хроматография 3

2. Сорбенты  в тонкослойной хроматографии 6

3. Подвижные  фазы в тонкослойной хроматографии 9

4. Количественный  анализ 13

6. Применение  для решения практических задач 17

Список  литературы 24

 

 

1. Планарная (тонкослойная) хроматография

Тонкослойная (планарная) хроматография  занимает одно из ведущих мест в  качественном и полуколичественном анализе сложных природных, фармацевтических, медикобиологических и химических объектов. Среди других хроматографических методов планарную хроматографию отличают следующие достоинства и особенности:

• это единственный хроматографический метод, позволяющий проводить полный анализ неизвестной смеси, поскольку исследователь имеет возможность проверить, не остались ли на старте неэлюированные компоненты;
• по производительности превосходит газовую и высокоэффективную жидкостную хроматографию, по крайней мере, на порядок; использует более простое и дешевое оборудование;
• обладает высокой селективностью, которую легко варьировать, подбирая состав подвижной фазы; в отличие от ВЭЖХ нет ограничений в выборе растворителей;
• дает возможность одновременного разделения нескольких образцов; использования однократного или многократного элюирования (при различных условиях), а также одновременного разделения компонентов одного и того же образца с помощью различных элюентов;

- возможна оптимизация разрешающей способности

хроматографической системы при разделении сложной смеси только для интересующих компонентов, что позволяет экономить время;

- возможно детектирование соединений с высокой

чувствительностью и селективностью, которые легко варьировать

подбором проявляющего реагента; полученные результаты разделения легко оценить  визуально;

• можно сохранять хроматограммы для последующего детектирования и осуществлять спектральную идентификацию хроматографических зон после разделения в любом диапазоне длин волн, включая ИК.

У планарной хроматографии есть и некоторые недостатки:

• ограниченная разделяющая способность из-за сравнительно небольшой длины разделяющей зоны (3-10 см);
• чувствительность ниже, чем в случае ВЭЖХ;
• зависимость результатов анализа от окружающей среды: относительной влажности, температуры, а также наличия загрязняющих веществ в воздухе;
• трудности в работе с образцами, имеющими высокую летучесть, а также с веществами, чувствительными к действию кислорода воздуха или света.

Классическая, наиболее простая и  широко используемая методика тонкослойной хроматографии включает проведение следующих основных операций:

1. нанесение анализируемой пробы на слой сорбента;
2. разделение компонентов пробы на отдельные зоны в потоке подвижной фазы;
3. обнаружение зон на слое сорбента (часто реагентом, образующим с разделенными веществами окрашенные соединения);
4. количественная оценка полученного разделения, включая определение величины удерживания и определение содержания вещества в зонах на хроматограмме.

Положение зоны вещества на хроматограмме характеризуется величиной R_f, которая равна отношению расстояния от стартовой линии до центра зоны вещества к расстоянию от стартовой линии до линии фронта. Значение R_f - величина постоянная для данного соединения в данной системе и зависит от ряда условий: способа элюирования, качества и активности сорбента, толщины слоя, качества растворителей, количества нанесенного вещества, длины пробега растворителей, положения стартовой линии и почти не зависит от температуры. По этой величине проводят идентификацию компонентов в смеси.

На качество разделения компонентов  смеси в планарной хроматографии  влияет большое число факторов: тип  разделительной камеры; предварительное  насыщение камеры и слоя сорбента парами подвижной фазы; стартовый  размер пятна; расстояние от старта до нижнего края пластинки; относительная  влажность воздуха лабораторного  помещения; средний диаметр частиц и их форма; толщина и равномерность  нанесения слоя сорбента; наличие  микроповреждений слоя; тип вещества, связывающего сорбент; скорость элюирования; объем растворителя в камере; наличие  примесей в элюенте; конвекция в  газовой фазе внутри камеры.

Для разделения смесей веществ в  тонком слое сорбента применяют адсорбционную, распределительную и ионообменную хроматографию, отличающиеся, прежде всего  характером взаимодействий между растворенными  веществами и твердой или жидкой фазами, с которыми они соприкасаются. На практике эти взаимодействия почти  никогда не протекают изолированно, и разделение веществ обусловлено  несколькими взаимодействиями. При  выборе подходящего варианта хроматографии в первую очередь следует обратить внимание на строение разделяемых веществ. При помощи адсорбционной и распределительной хроматографии разделяются вещества, строение которых различается природой, числом и характером полярных и неполярных заместителей. При хроматографировании в тонком слое сорбента чаще всего применяют адсорбционную хроматографию, которая проще по выполнению, более эффективна, а результаты анализа более воспроизводимы.

2. Сорбенты в тонкослойной хроматографии

В качестве сорбентов в ТСХ применяют  материалы, которые отвечают следующим  требованиям: образуют химически и  физически стабильные слои; не образуют ковалентных связей с разделяемыми веществами; не растворяются в подвижной  фазе или перемещаются вместе с ней  по пластинке; не содержат компонентов, мешающих разделению или детектированию; не имеют собственной окраски; не набухают и не сжимаются под действием  подвижной фазы.

В качестве подложки для сорбента используется стекло, алюминевая фольга, полимерные пленки (полиэтилентерефталат). Для придания стабильности слоя сорбента на подложке используются различные связующие вещества: гипс (5-10%), силиказоль, силикаты щелочных металлов, полиакриламид, полиакриловый эфир, крахмал. К адсорбенту часто добавляют флуоресцентный индикатор для детектирования веществ, поглощающих в УФ-области спектра. С этой целью используют: смесь силикатов цинка и магния; смесь сульфидов цинка и кадмия; вольфраматы щелочноземельных элементов.

Большое значение, особенно для эффективности  разделения, имеют такие характеристики сорбентов, как диаметр частиц, среднее  распределение частиц по размерам и  размер пор. В классической тонкослойной хроматографии для производства пластинок используются частицы  с размером 5 - 20 мкм. Для высокоэффективной  тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ) необходим  сорбент, диаметр частиц которого составляет 5 - 7 мкм. Сравнение характеристик  пластинок для ТСХ и ВЭТСХ приведено в табл.1. Монолитные сорбенты представляют собой новое поколение стационарных фаз, которые могут быть использованы и в планарной хроматографии. Их получают прямой сополимеризацией

Таблица 1. Сравнение характеристик пластинок для классической (ТСХ) и высокоэффективной (ВЭТСХ) тонкослойной хроматографии.

Характеристики	ТСХ	ВЭТСХ
Средний размер частиц, мкм	5 - 20	5 - 7
Толщина слоя, мкм	250	100, 200
Количество проб	12	36 - 72
Длина пробега фронта растворителя, мм	100 - 150	30 - 50
Время разделения, мин	30 - 200	3 - 20
Количество растворителя, мл	50	5 - 10
Предел детектирования, нг
поглощение	100 - 1000	10 - 100
флуоресценция	1 - 100	0,1 - 10

 

метакриловых полимеров, например, сополимера глицинметакрилата и этилендиметакрилата. Монолитные стационарные фазы не содержат частиц, а роль разделительного пространства выполняют поверхность и объем проточных каналов (пор). Макропористая структура монолитных сорбентов содержит как минимум два вида пор: макро- и мезопоры. Преимущества таких носителей заключаются в заметном повышении скорости и эффективности разделения, так как для них отсутствуют обычные диффузионные ограничения межфазного массообмена.

Основные типы сорбентов, используемых в ТСХ, описаны ниже.

Силикагель - полярный адсорбент, содержит активные силанольные и силоксановые группы, его применяют для разделения соединений различной полярности.

Оксид алюминия - полярный адсорбент с гетерогенной поверхностью, содержит активные ОН-группы, обладает заметно

выраженными протоноакцепторными свойствами; его применяют для разделения ароматических углеводородов, алкалоидов,

хлоруглеводородов, стероидов

Флоросил - основной силикат магния, занимает промежуточное положение между оксидом алюминия и силикагелем; удобен для разделения флаваноидов, стероидов и ацетилированных углеводородов

Полиамиды - группа полярных сорбентов со смешанным механизмом разделения: карбоксамидная группа ответственна за адсорбционный механизм, метиленовые звенья - за распределительный механизм. Эти сорбенты применяют для разделения пищевых красителей, флаваноидов, танинов, нитрофенолов, спиртов, кислот.

Модифицированные силикагели с привитыми группами (амино, циано, диол-, С₂-,С₈-, С18-), отличными по полярности.

Важной характеристикой сорбента является его активность, она зависит  от содержания воды и понижается при  увеличении содержания воды в сорбенте.

Для успешного разделения смесей веществ  большое значение имеет выбор  сорбента. В первую очередь нужно  исходить из свойств разделяемых соединений: их растворимости  (гидрофильности, гидрофобности), содержания и характера функциональных групп. Насыщенные углеводороды адсорбируются слабо или совсем не адсорбируются на силикагелях и оксиде алюминия. Введение двойных связей, особенно сопряженных, увеличивает адсорбционную способность соединений.

Функциональные группы в еще  большей степени усиливают способность  веществ к адсорбции. Адсорбционная  способность функциональных групп  возрастает в следующем порядке: CH=CH<OCH₃<COOR<C=O<CHO<SH<NH₂<OH<COOH.

3. Подвижные фазы в тонкослойной хроматографии

Растворители, применяемые в тонкослойной хроматографии, должны быть чистыми  и осушенными. Смеси веществ могут  разделяться с помощью одного растворителя, однако обычно применяют системы, состоящие из двух, трех и даже четырех растворителей. Выбор растворителей определяется их элюирующей способностью, которая зависит от полярности растворителя, а также его протонодонорных и протоноакцепторных свойств. Характеристика элюирующей способности наиболее важных для ТСХ растворителей приведена в табл.2. и 3. Для каждой новой пластинки систему растворителей следует готовить заново, так как в ней соотношение компонентов после хроматографирования изменяется. Существенную роль при разделении веществ с помощью тонкослойной хроматографии играет количество наносимой смеси, оно влияет и на величину R_f и на разрешение пятен. Пробы испытуемых веществ массой от 0,1 до 50 мкг, наносят на пластинку в виде растворов в эфире, хлороформе или другом летучем растворителе.

Таблица 3. Значения силы растворителя S_i для полярных неподвижных фаз

Группа( по Снайдеру)	Растворитель	Si
I	н-Гексан	0
	н-Бутиловый эфир	2,1
	Изопропиловый эфир	2,4
	Метил-трет-бутиловый	2,7
	эфир Диэтиловый эфир	2,8
II		3,9
	1-Бутанол	3,9
	2-Пропанол	4,0
	1-Пропанол	4,3
	Этанол Метанол	5,1
III		4,0
	Тетрагидрофуран	5,3
	Пиридин	5,5
	Метоксиэтанол Диметилформамид	6,4
IV		6,0
	Ледяная уксусная кислота Формамид	9,6
V		3,1
	Дихлорметан 1,2-Дихлорэтан	3,5
VI		4,4
	Этилацетат	4,7
	Метилэтилкетон	4,8
	Диоксан	5,1
	Ацетон Ацетонитрил	5,8
VII		2,4
	Толуол Нитробензол	4,4
VIII		4,1
	Хлороформ	6,0
	Нитрометан Вода	10,2

 

Природа растворителя может влиять на размер пятна наносимой пробы. При нанесении пробы необходимо, чтобы: растворитель легко удалялся со стартовой зоны, и растворимость анализируемых веществ была бы не менее 0,01 г/мл.

Рис. 1. Варианты элюирования компонентов в тонкослойной (планарной) хроматографии.

Пробы наносят в виде точки или  полоски длиной 5-7 мм при помощи капилляра, пипетки на 0,1 мл или микрошприца, предварительно отметив стартовую линию на расстоянии 1,5 см от края пластинки. Расстояние между отдельными пробами должно быть не менее 1 см. После этого ждут, когда растворитель испарится, затем пластинку опускают в разделительную камеру с выбранной подвижной фазой. В зависимости от того, в каком направлении поступает растворитель на пластинку, различают методы восходящей, нисходящей и горизонтальной хроматографии. На рис. 1 показаны различные методы элюирования в планарной хроматографии. Применение многоступенчатого и двумерного