Агарозний гель електрофорез ДНК

 

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА №

 

Тема  роботи: АГАРОЗНИЙ ГЕЛЬ ЕЛЕКТРОФОРЕЗ ФРАГМЕНТІВ ДНК

Теоретична частина

Горизонтальний агарозний гель електрофорез це – методом, який використовується  в молекулярній біотехнології, для розділення фрагментів ДНК та РНК різної довжини. Молекули нуклеїнових кислот розділяють застосовуючи електричне поле, в результаті чого негативно заряджені частинки рухаються в агарозному гелі. Молекули з меншої довжини переміщуються швидше та мігрують у гелі далі, порівняно з довшими фрагментами. Гель електрофорез використовується як антиконвективне середовище, тобто середовища в якому відбувається «просіювання» рух заряджених частинок під дією електричного поля. Гелі пригнічують теплову конвекцію, викликану електричним полем та виконують функцію середовища просіювання (сита). Гель електрофорез ДНК зазвичай виконується в аналітичних цілях, часто після збільшення кількості специфічних фрагментів ДНК за рахунок полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), а також як підготовчий етап для встановлення якості виділення ДНК.

Рис. 1. Камера для горизонтального гель електрофорезу

Молекули  ДНК вносяться в лунки  та розподіляються в гелі. Гель заливають в камеру для електрофорезу, яку потім підключають до джерела живлення. Під дією сили струму великі молекули рухаються в гелі повільніше в той час як менші молекули рухаються швидше. Як результат молекули різної молекулярної ваги (різної довжини) формують різні лінії «бенди» в гелі. 

Агароза  складається з довгих послідовностей лінійних полісахаридів, утворених чергуванням залишків β-D-галактопіранози та 3,6-ангідридо-α-1-галактопіранози з’єднаних 1-4 глікозидними зв’язками. Різні зразки внесені в суміжні лунки будуть рухатися паралельно, але з різною швидкістю в залежності від молекулярної ваги фрагментів ДНК. В залежності від кількості різних молекул в пробі, кожна лінія демонструватиме окремий компонент вихідної суміші.

Лінії в гелі, які знаходяться  на однаковій відстані від початку гелевого блоку містять молекули, які рухаються з однаковою швидкістю, що зазвичай свідчить, що вони майже однакового розміру. Для того, щоб встановити  довжини фрагментів використовують маркери відомого розміру.

Агарозний гель електрофорез може використовуватися для розподілу фрагментів ДНК в межах від 50 пар основ до декількох мільйонів. Відстань між фрагментами ДНК різної довжини залежить від відсотка агарози в гелі. Використання гелів з вищою концентрацією дає можливість отримати більш чіткі лінії проте недоліком є довгий часи проходження електрофорезу (іноді дні).

Більшість агарозних гелів готується  в межах від 0,7 % (хороший розподіл великих молекул, розподільча здатність фрагментів ДНК – 5-10 тис. пар основ ) до 2 % (хороша розподільча здатність для маленьких фрагментів – 0,2-1 тис. пар основ) агарози.

Гелі з концентрацією  до 3 % можуть використовуватися лише для розділення дуже маленьких фрагментів, але в даному випадку вертикальний поліакриламідний гель електрофорез є більш ефективним. Гелі з низькою концентрацією агарози можуть зламатися, тому переносити їх з камери на транселюмінатор необхідно дуже обережно.

Рис. 2. Приготування гелю та внесення проб у лунки

 

Оцінити процес проходження електрофорезу фрагментів ДНК можна візуально, контролюючи  переміщення барвника. Барвники бромофенол синій  та ксилен цианол рухаються в агарозному гелі приблизно з такою ж швидкістю, що і фрагменти двоспіральної ДНК 300 та 4000 пар основ, відповідно.

 

Переміщення фрагментів ДНК в агарозі

Фрагменти лінійної ДНК мігрують через агарозний  гели зі швидкістю, яка обернено пропорційна  до log₁₀ їх молекулярної ваги. Кільцеві молекули ДНК рухаються в агарозному гелі інакше порівняно з лінійними тієї ж молекулярної ваги.

Здавалося б, нерозрізана плазміда, буде рухатись швидше в гелі ніж та сама лінеаризована, проте більшість приготованих нерозрізаних (кільцевих) плазмід знаходяться, як мінімум, в двох різних формах. Так плазміди в суперскрученій формі рухаються швидше ніж лінеаризовані, а кільцеві ниткоподібній повільніше.

На рис. 3. ліворуч показано переміщення в агарозному гелі нерозрізаних плазмід в двох різних формах та праворуч лінеаризованої плазміди.

 

Рис. 3. Електрофорез плазмідної ДНК

 

 

 

 

Чинники, які значно впливають на рухливість фрагментів ДНК в агарозному гелі:

- Концентрація агарози: при використанні гелів з різними концентраціями агарози можна розділити фрагментів ДНК різних довжин. Вищі концентрації агарози дають можливість провести розподіл менших фрагментів ДНК, тоді як низькі концентрації агарози дозволяють розподілити в гелі великі фрагменти ДНК. На рис. 4 показано переміщення ряду фрагментів ДНК в агарозному гелі трьох різних концентрацій, які розподілялься в одній і тій же камері, за використання однакової напруги та протягом  однакового проміжку часу. Зверніть увагу, як великі фрагменти набагато краще розподілені в гелі на 0.7 %, тоді як маленькі фрагменти відокремилися краще в 1.5 % агарозі. На рис. 4. в кожній доріжці гелю відмічено фрагмент довжиною 1000 пар основ.	Рис. 4. Розподіл фрагментів ДНК
- Напруга: Оскільки напруга прикладена до гелю збільшується, то великі фрагменти мігрують пропорційно швидше порівняно з маленькими. Саме тому кращий розподів фрагментів, більше ніж 2 тис. пар основ, досягається при застосуванні напруги не більше ніж 5 В на см2 гелю.
- Буферні системи для електрофорезу: На сьогоднішній день рекомендовано декілька різних буферів для електрофорезу фрагментів ДНК. Зазвичай для подвійної ДНК використовують ТАЕ (Трис-ацетат-ЕДТА) та TBE (Трис-борат-ЕДТА). Фрагменти ДНК мігрують в гелі за різних умов в цих двох буферних системах, оскільки розчини мають різну іонну силу. Буфера не лише визначають  pH показник, але і забезпечують іони для підтримки електропровідності. Якщо Ви помилково використовуєте воду замість буфера, то по суті не буде ніякого переміщення ДНК в гелі. І навпаки, якщо ви використовуєте концентрований буфер (наприклад, 10×), даний процес буде супроводжуватися виділенням великої кількость тепла, що може призвести до плавлення гелю.
- Значення етидію броміду (бромистого етидію): бромистий етидій - флуоресцентний барвник, який зв’язується з азотистими основами нуклеїнових кислот і дозволяє виявити фрагменти ДНК в гелях (рис. 4). Барвник може бути внесений в гель агарози або доданий до зразків ДНК. Зв’язаний бромистий етидій з ДНК змінює свою масу, а відповідно і рухливість в гелі.

Візуалізація результатів

Візуалізація результатів

Під час електрофорезу проводять фарбування макромолекул, щоб зробити їх видимими. ДНК можна візуалізувати використовуючи бромистий етидій, який під ультрафіолетовим світлом дає флюорисцентне свічіння, тоді як білок можна візуалізуватися, використовуючи азотнокисле срібло або барвник кумасі. Щоб візуалізувати розподіл компонентів суміші в гелі також можуть використовуватися інші методики. Найбільш поширений барвник, що дає можливість візуалізувати ДНК або групи РНК в гелю є бромистий етидій, який зазвичай позначається як EtBr. Він дає флуоресценцію під ультрафіолетовим світлом. Фрагменти ДНК, які рухаються через EtBr-гель накопичує даний барвник, що і дає можливість візуалізації цих молекул під ультрафіолетовим світлом. Інтенсивність флюорисценції залежить від кількості ДНК, тому для візуалізації необхідно не менше 20 нанограм ДНК. EtBr – відомий мутаген, тому зараз при можливості використовуються менш небезпечні барвники, такі як SYBR Green I, який в 25 разів більш чутливий та безпечніший ніж EtBr.

З того моменту, як молекули ДНК зв’язались з EtBr, вони не видимі в природному світлі. Перш ніж внести суміш ДНК та барвника до гелю, ДНК змішують з негативно зарядженим буфером. Ксилен та бромфеноловий синій  є загальними барвниками які додаються до буферів, оскільки вони дають можливість спостерігати ДНК в природному світлі та рухаються в гелі з такою ж швидкістю як фрагменти ДНК довжиною від  300 до 5000 пар основ. Рідше використовуються маркери руху молекул в гелі такі як: Cresol Red, Orange G, які рухаються з такою ж швидкістю як молекули ДНК довжиною 125 та 50 пар основ, відповідно.

Застосування:

- Оцінка розміру молекул ДНК після обробки ферментами - рестриктазами, наприклад, при картуванні клонованої ДНК.

- Аналіз продуктів ПЛР, наприклад, в молекулярно-генетичній діагностиці або генетичному фінгерпринтінгу.

- Розподіл фрагментів геномної ДНК для проведення Southern блотингу.

 У випадку  з нуклеїновими кислотами, переміщення  від негативного до позитивного електроду відбувається завдяки негативному заряду їх цукрово-фосфатного остову. 

Одноланцюгові ДНК або РНК мають тенденцію складатися в молекули із складною конфігурацією та повільно рухатися через гель в зв’язку  з їх третинною структурою. Тому для розділення фрагментів ДНК або РНК часто використовують гідроокис натрію або формамід, які руйнують водневі зв'язки між комплементарними основами.

Кількість ДНК  необхідна для аналізу

У випадку, якщо необхідно перевірити  чи вдалося виділити ДНК з біологічного матеріалу, в гель з етидіумом-бромідом вносять 20 нанограм проби ДНК.

Для візуалізації продуктів полімеразно-ланцюгової реакції зазвичай використовують 10-20 мікролітрів в залежності від умов реакції.

Маркери довжини  фрагменту ДНК

Існує велика кількість маркерів розміру ДНК, зокрема такі як: лямбда HindIII, лямбда PstI, PhiX174. Вони дають можливість спостерігати в гелі лінії з відомими довжинами.

Маркери підбирають в залежності від того якої довжини  фрагменти ДНК  розраховують отримати. Для продуктів ПЛР невеликого розміру обирають PhiX174, а для фрагментів 6 тис. пар основ – лямбда HindIII.

Зараз компанії виробники пропонують маркери з  групами «бендів» в певних інтервалах: 0,5; 1,0; 1,5; 2; 2,5 тис. п.о. і так далі до 10 тис. п.о.

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Гель-электрофорез ДНК

 

Існує декілька способів підготовки гелів для електрофорезу. Вони відрізняються буферними системами, які використовуються, об’ємом проби, яка буде завантажена, сумарним об’ємом гелю (як правило, товщина зведена до постійної, в той час як довжина та ширина відрізняються).

Обладнання  для агарозного гель електрофорезу:

- камера для горизонтального гель електрофорезу  та блок живлення;

- кювета для  заливки гелю;

- типові гребінки  для створення лунок;

-транселюмінатор (ультрафіолетовий лайтбокс), який використовується  щоб візуалізувати ДНК з етидіумом броміду.

Матеріали

1. 10 х буфер Трис-борат-ЕДТА (ТБЕ): 0,9 М Трис, 0,9 М борна кислота, 20 мМ ЭДТА. рН доводят до 8,1—8,2 сухою борною кислотою.

2. Агароза (для електрофорезу)

3. Бромистий етидій: 10 мг/мл в стерильній дистильованій воді.

4. барвник для нанесення  проб: 0,25% бромфеноловый синий, 40% (в/о) сахароза в 1×ТБЕ.

 

Хід роботи

 

1. Приготуйте робочий  розчин буферу Трис-борат-ЕДТА  10xTBE:

- 218 г.  Трис;

- 110 г. борної кислоти;

- 9.3 г EDTA.

Розчиніть компоненти в 1,9 л дистильованої води. pH показник доведіть до 8,3 сухою борною кислотою або розчином NaOH. Об’єм розчину розведіть до 2 л дистильованою водою.

2. З робочого розчину приготуйте 1×ТБЕ в об’ємі, достатньому для заповнення камери для електрофорезу та приготування гелю.

3.Додайте до 1×ТБЕ агарозу в кількості, необхідній для отримання 0,45% – 0,75% розчину та  нагрівайте на водяній бані до повного розчинення агарози.

4. Охолодіть суміш ≈ до 50 °С. За час охолодження заклеюють края кювети для геля  клейкою стрічкою.

5. Додайте до розчину агарози бромистий етидій до кінцевої концентрації 0,5 мкг/мл та обережно перемішайте уникаючи виникнення в гелі пухирцій повітря.

6. Теплу агарозу влийте в кювету для геля і рівномірно розподіляють її в кюветі. Вертикально вставляют гребінку так, щоб її зубчики не доторкалися до дна кювети приблизно на 1,5 мм.

7. Залиште кювету з агарозним гелем на 30 хв, потім обережно видаліть гребінку та клейку стрічку. Кювету с гелем помістіть в камеру для лектрофорезу, яка містить необхідну кількість 1×ТБЕ з бромистим етидієм в кінцевій концентрації 0,5 мкг/мл.

8. Підготуйте до електрофорезу зразкик досліджуваної ДНК, для чего їх змішують з с буфером для нанесення (5:1). Щоб отримати чіткий сигнал після забарвлення бромистим етидієм, в лунку шириною 5 мм достатньо внести 200 нг маркерної ДНК. Для побудови стандартної кривої необхідно використовувати маркерні фрагменти, довжина, яких приблизно рівна   довжині досліджуваної ДНК.

9. Обережно внесіть в лунку досліджувану  та маркерну ДНК. Для підвищення точності визначення розміру фрагменту ДНК, маркерну ДНК вносять з обох боків від досліджуваної.

10. Підключіть електроди горизонтальної камери для електрофорезу до джерела живлення та виконайте електрофоретичне розділення фрагментів ДНК при градієнті напруженості 1–3 В на 1 см геля в протягом 1–3 год.

11. Вийміть шпателем агарозний гель, перенесіть на трансілюмінатор та в ультрафіолетовому світлі проаналізуйте результати розділення фрагментів ДНК.

12. Зафіксуйте результати за допомогою фотосистеми.