Биохимические тесты для диагностики заболеваний костной ткани

 

Регуляция обмена кальция в организме.

Система регуляции гомеостаза кальция состоит из двух петель, работающих по принципу отрицательной обратной связи (рис. 1). Одна из этих петель может быть обозначена как внутренняя, а другая - как внешняя. Внутренняя петля регулирует поступление кальция из костной ткани в плазму. Она включает околощитовидные железы и кости. Любое снижение уровня ионизированного кальция [Са2+] в плазме крови стимулирует секрецию паратиреоидного гормона (ПТГ), под влиянием которого в костной ткани активизируются остеокласты, что приводит к усилению ее резорбции и, таким образом, к поступлению в кровь кальция. Внешняя петля регуляции кальциевого гомеостаза включает околощитовидные железы, почки и кишечник. Под влиянием ПТГ, стимулированного снижением кальция в крови, с одной стороны, возрастает реабсорбция кальция в дистальных извитых канальцах, а с другой стороны, усиливается синтез 1,25(OH)2D3 (кальцитриола) в прокси

 

 

мальных извитых канальцах почки. В результате снижается экскреция кальция с мочой, а под влиянием кальцитриола усиливается его абсорбция в кишечнике. Оба эффекта способствуют восстановлению уровня кальция в крови. Кроме того, усиливает костную резорбцию и, в некоторой степени, подавляет секрецию ПТГ (рис. 1).

Рис. 1. Система регуляции гомеостаза кальция

 

Фосфор.

Фосфор относится к жизненно необходимым веществам, он входит в состав всех тканей организма, особенно мышц и мозга, участвует во всех видах обмена веществ, необходим для нормального функционирования нервной системы, сердечной мышцы и т. д. В тканях организма и пищевых продуктах фосфор содержится в виде фосфорной кислоты и органических соединений фосфорной кислоты (фосфатов). Основная его масса находится в костной ткани в виде фосфата кальция, остальной фосфор входит в состав мягких тканей и жидкостей. В мышцах происходит наиболее интенсивный обмен соединений фосфора. Фосфорная кислота участвует в построении молекул многих ферментов, нуклеиновых кислот и т. д.

Содержание органических соединений фосфора в крови человека меняется в значительных пределах. Однако количество неорганического фосфора более или менее постоянно - 3 - 5,5 мг% . Увеличивается содержание неорганического фосфора при молочной диете, а также при ряде заболеваний  

 

 

почек, при переломах в стадии заживления. сахарном диабете, акромегалии, аддисоновой болезни и др.; уменьшается концентрация неорганического фосфора в сыворотке крови при повышении функции паращитовидных желез и ряде других заболеваний. При голодании организм расходует фосфор, содержащийся в тканях, поэтому концентрация его в крови не меняется, и лишь при потере 40% общего количества содержание его в крови уменьшается на 10%.

Фосфор. Около 80% фосфора в организме человека связано с кальцием и образует неорганическую основу костей и служит резервуаром фосфора (Долгов В.В., Ермакова И.П., 1998). Внутриклеточный фосфор представлен макроэргическими соединениями, это - кислоторастворимый фосфор. Фосфор также является составной частью фосфолипидов - основных структурных компонентов мембран.

Суточное потребление фосфора 0,6-2,8 г (Москалев Ю.И., 1985). Обычно всасывается около 70% поступившего с пищей фосфора, и этот процесс зависит от содержания кальция в пищевых продуктах и образования нерастворимых солей. Фосфор и кальций образуют плохо растворимые соединения, поэтому их общая концентрация не превышает определенного уровня и повышение одного из них, как правило, сопровождается снижением другого (Pak C.Y.C., 1992). Высокое содержание в пище магния, железа и алюминия также снижает всасывание фосфора. Витамин D и липиды, наоборот, способствуют всасыванию фосфора.

В плазме неорганический фосфор содержится в виде анионов НРО4-2 и Н2РО4-, общее их количество 1-2 мМ. Около 95% - это свободные анионы, 5% связаны с белком.

При почечной недостаточности снижение клубочковой фильтрации на 20% относительно нормы вызывает гиперфосфатемия. Вследствие этого снижается синтез кальцитриола и всасывание кальция в кишечнике (Rowe P.S., 1994). Тканевой катаболизм является частой причиной гиперфосфатемии у больных с диабетическим кетоацидозом. Причины гипофосфатемии - дефицит витамина D, синдром мальабсорбции, первичный и вторичный гиперпаратиреоз, диабетический кетоацидоз (фаза восстановления), почечная тубулярная недостаточность, почечная тубулярная недостаточность, почечная тубулярная недостаточность, алкогольный делирий, алколоз, гипомагниемия. В норме канальцевая реабсорция равна 83-95%. Уменьшение канальцевой реабсорбции фосфата обусловлено повышением уровня ПТГ либо первичным дефектом реабсорбции фосфата в почечных канальцах.

 

 

 

 

Регуляция обмена фосфора в организме.

Почки играют ведущую роль в поддержании гомеостаза фосфора и его концентрации в крови. Механизм регуляции гомеостаза фосфора тесно связан с так называемым «канальцевым фосфорным порогом» или величиной максимальной тубулярной реабсорбции фосфата (МТРФ).

Гормональная регуляция обмена кальция и фосфора. Гомеостаз кальция в организме обеспечивается системой ПТГ–КТ–витамин D. Основная функция всех этих  гормонов – регуляция движения Са2+ и фосфатов в организме и поддержание постоянства концентрации Са 2+  в крови. Метаболизм кальция в костной ткани (в процессе роста, развития, ремоделирования) и поддержание кальциевого гомеостаза в организме — сопряженные процессы. Их согласованность регулируется и контролируется на системном уровне (так называемые дистантные регуляторы), а также локальными, или местными, факторами (табл.)                                                 Системные (гормональные) и локальные регуляторы ремоделирования костной ткани (Canalis, 1990) Гормоны Локальные факторы Белковой природы:  ПТГ  КТ  инсулин  гормоны роста  Стероидной природы:  1,25-(OH)2D3  ГК Синтезируемые  (предположительно)  костными клетками:  IGF-1  β2-микроглобулин  ТФР-β  ФРФ  ТцФР Гормоны щитовидной  железы Синтезируемые костноза-  висимыми тканями:  в хрящевой ткани: ФРФ,  ТФР-Р, ИФР-1  в крови: ИЛ-1, ФНО   Другие факторы  локального действия:  простагландины, неколлагено-  вые белки, цитокины Примечание:  ТФР – трансформирующий фактор роста, ФРФ – фактор роста фибробластов ТцФР – тромбоцитарный фактор роста.    Паратгормон (ПТГ). Cинтезируется паратиреоидными  железами в ответ на уменьшение  внеклеточной концентрации кальция. Он активирует остеокласты, т.е. резорбцию и приводит к поступлению в кровь кальция и фосфора. Интактный ПТГ быстро подвергается протеолизу с образованием четырех фрагментов. N-концевой фрагмент сохраняет полную биологическую активность и тоже быстро расщепляется в крови. С-концевые фрагменты и фрагменты средней части ПТГ циркулируют в крови дольше в концентрациях, в 5-10 раз превышающих интактный и Nконцевой ПТГ. Все фрагменты и сам гормон выделяются почками. Концентрации ПТГ и кальция в организме имеют обратную зависимость. Абнормальные уровни ПТГ следует проверить измерением в сыворотке кальция. Увеличение содержания гормона в крови характерно для различных форм гиперпаратиреоидизма, включая множественную эндокринную неоплазию I и II типов, опухоли околощитовидных желез и идиопатический гиперпаратиреоидизм. Низкий или нормальный уровень ПТГ при чрезвычайно высокой концентрации кальция в крови связан со злокачественной гиперкальциемией. Абнормальное содержание ПТГ при нормальном содержании кальция в крови характеризует почечную остеодистрофию. Кроме того, для характеристики метаболических сдвигов при гиперпаратиреозе рекомендуется исследовать почечный клиренс фосфата, а также провести подробный биохимический анализ больного. У больных с терминальной стадией почечной недостаточности часто возникает гиперкальциемия, которая развивается из-за автономной секреции ПТГ, особенно, если этому предшествовала гипокальциемия. Такая же гиперкальциемия может первое время поддерживаться у больных после трансплантации почки, у которых нормализуется способность метаболизировать витамин D. Это состояние получило название третичного гиперпаратиреоза.     Наиболее распространенные методы иммуноанализа основаны на выявлении средних фрагментов или С-концевого фрагмента. Однако при почечной недостаточности в крови накапливаются С-концевые фрагменты ПТГ, и определяемый уровень ПТГ оказывается искусственно завышенным. ЗАО «БиоХимМак» предлагает тест-систему на основе двух видов высокоспецифичных поликлональных антител, которые реагируют с эпитопами N-терминальной части интактного ПТГ. 25-ОН витамин D (25-OH D). Витамин D является стероидом, участвующим в кишечной абсорбции кальция и регуляции гомеостаза кальция. Известны две различные формы витамина D – D 3 и D 2 , которые имеют очень близкое строение. Последний представляет собой синтетический продукт, который преимущественно абсорбируется из обогащенных пищевых продуктов. Физиологический уровень D3 зависит от его поступления с пищей, а также от процессов его биосинтеза в коже из 7-дегидрохолестерола под влиянием ультрафиолета солнечных лучей. Синтезированный витамин далее при участии микросомального фермента 25-гидроксилазы преобразуется в печени с образованием 25-   гидроксивитамина D (25OH D), являющегося главным циркулирующим метаболитом витамина D. Несмотря на то, что биологически активной является форма 1,25-(OH) 2 D, синтезируемая в почках, определение циркулирующего 25-OH D широко признано в качестве метода диагностики гиповитаминоза. Концентрация 25-OH D снижается с возрастом, у лиц пожилого возраста обычно наблюдается дефицит витамина D. Клинически определение 25-OH D используется для диагностики и контроля лечения постменопаузального ОП, рахита, остеомаляции, почечной остеодистрофии, при беременности, неонатальной гипокальциемии и гипопаратиреозе. Также в последнее время обсуждается проблема субклинического дефицита витамина D в различных европейских странах. Интоксикация витамином D наблюдается в основном при передозировке его фармакологических препаратов и может приводить к гиперкальциемии, гиперкальциурии и нефрокальцинозу у предрасположенных детей.     1,25(OH) 2 витамин D 3 (кальцитриол). 1,25(OH) 2 D 3 образуется в  митохондриях клеток почек под  действием 1-гидроксилазы и является  наиболее активной формой витамина D 3 . По своему действию 1,25(OH) 2 D 3 является прямым антирахитическим фактором и его механизм действия подобен стероидным гормонам. После синтеза в почках он транспортируется кровью в кишечник, где в клетках слизистой оболочки стимулирует синтез кальцийсвязывающего протеина, который участвует во всасывании кальция из пищи. В результате этих процессов уровень кальция в крови повышается. На секрецию 1,25(OH) 2 D 3 почками влияет содержание кальция и фосфора в пище. Сам он также дейс твует как регулятор: его избыток ингибирует синтез и секрецию паратгормона. Избыток ионов кальция в крови, вызванный избытком 1,25(OH) 2 D 3  также ингибирует высвобождение паратгормона. Пролактин и соматотропный гормоны являются важными регуляторами метаболизма витамина D во время беременности и роста. Потеря 1,25(OH) 2 D 3 ведет к гипокальциемии, остеомаляции и связанным с ними расстройствам. Измерение 1,25(OH) 2 D 3 – не слишком хороший показатель для оценки общего статуса витамина D, но оно применяется для дифференцирования первичного гиперпаратиреоидизма от гиперкальциемии при раке; помогает отличить витамин D-зависимый и витамин D-резис тентный рахит; используется для мониторирования статуса витамина D      у больных с хронической почечной недостаточнос тью и для оценки эффективности 1,25(OH) 2 D 3 терапии.     Кальцитонин (КТ) Синтезируется и секретируется парафолликулярными С-клетками щитовидной железы. Основное его действие – это снижение концентрации кальция в плазме через ингибирование активности остеокластов, приводящее к уменьшению высвобождения кальция из кости. Секреция КТ стимулируется увеличением концентрации кальция в плазме и регулируется желудочно-кишечными пептидами, эстрогенами и витамином D. Абнормально высокие уровни КТ характерны для С-клеточной гиперплазии или медуллярной тироидной карциномы. Хотя точный механизм действия КТ не ясен, несомненна его терапевтическая роль, причем КТ некоторых рыб более активен в организме человека, чем его собственный гормон. При интерпретации результатов следует иметь в виду, что увеличение концентрации КТ наблюдается также при беременности; при лечении эстрогенами; после внутривенного введения кальция; гастрина и пентагастрина; после приема алкоголя. В системной регуляции кальциевого гомеостаза заметная роль принадлежит ряду других гормонов. К их числу относятся тиреотропные гормоны, глюкокортикоиды, гормоны роста, половые гормоны, а также упоминавшиеся гастроинтестинальные гормоны. Их изолированное действие и, особенно, кооперативные эффекты во многом не ясны и активно изучаются. Известно, что благодаря наличию глюкокортикоидных цитоплазматических рецепторов в остеобластах возможен прямой ингибирующий эффект, в частности, кортизола на синтетическую активность остеобластов, что приводит к замедлению костеобразования. Эстрадиол вызывает дифференцировку ранних остеобластов (клеток костеобразования), стимулирует синтез коллагена в кости и ингибирует активность остеокластов. Низкий уровень эстрадиола (<10 пг/мл) у женщин приводит к незначительной потере, а уровень ниже 5 пг/мл связан с сильной потерей костной массы. Кроме того, установлено, что и у мужчин наблюдается связь между низкой концентрацией эстрадиола (приблизительно 13 пг/мл), ОП и повышенным риском переломов. Обнаружено, что гипогонадизм у мужчин коррелирует с частотой переломов бедра. Тестостерон оказывает анаболический эффект на кости. Высокая концентрация SHBG в крови снижает биодоступность свободных гормонов и, таким образом, увеличивает риск переломов у женщин в постменопаузе и у мужчин. Этот транспортный белок также отрицательно коррелирует с BMD. Обнаружена положительная корреляция между ДГЭА и BMD у мужчин и женщин. Снижение уровня ДГЭА коррелирует с повышением риска переломов.

 

 Остаза – костный изофермент щелочной фосфатазы (ВАР)

Считается, что уровень костной щелочной фосфатазы в сыворотке отражает метаболическое состояние остеобластов – клеток, отвечающих за формирование кости.

Определение уровня костной щелочной фосфатазы в сыворотке отображает состояние костного метаболизма у пациентов, страдающих болезнью Педжета, остеомаляцией, первичным гиперпаратиреозом, нефрогенной остеодистрофией, остеопорозом и при костных метастазах. Определение общего уровня костной щелочной фосфатазы является общепринятым методом диагностики болезни Педжета и последующего мониторинга лечения.

Болезнь Педжета представляет собой общее поражение скелета для которого характерно наличие участков выраженной пролиферации на фоне нормальной костной ткани. Болезнь Педжета более распространена, чем считалось ранее, заболеваемость в некоторых популяциях достигает 3%–4% в среднем возрасте и 10% – 15% у пожилых людей. Это заболевание не встречается в юношеском возрасте. У большинства пациентов болезнь Педжета протекает бессимптомно, и диагноз ставится на основании данных рентгенологического обследования или определения высокого уровня щелочной фосфатазы в ходе обследования, не связанного с патологией костной ткани. Самые распространенные жалобы пациентов при болезни Педжета – боли в костях и их деформация.

Кроме этого, остаза – один из маркеров развития остеопороза – её рекомендуется определять для оценки степени разрежения костной ткани в комплексе с другими маркерами остеопороза (паратгормон, остеокальцин, CrossLaps и др.) Это разрежение сопровождается риском появления патологических переломов .

Определение Остазы обязательно назначают всем пациентам с повышенным общим уровнем щелочной фосфатазы. Это позволяет выявить причину повышения общей щелочной фосфатазы – дифференцировать различные заболевания печени от заболевания костей (в первую очередь, злокачественной природы).

 

 

 

Ферментная регуляция.

Щелочная фосфатаза (— фермент, участвующий в транспорте фосфора через мембрану клеток и являющийся показателем фосфорно-кальциевого обмена. Щелочная фосфатаза содержится в костной ткани, слизистой оболочке кишечника, гепатоцитах печени, в клетках почечных канальцев и в плаценте. Основной объем щелочной фосфатазы находится в слизистой оболочке кишечника (содержание щелочной фосфатазы в кишечнике в 30–40 раз больше, чем в ткани печени и поджелудочной железы и в 100–200 раз больше, чем в слюнных железах, слизистой оболочке желудка, желчи). Щелочная фосфатаза продуцируется поверхностным слоем слизистой оболочки кишечника, но её роль в пищеварении вторична. Основные ее функции связаны с процессами общего метаболизма.  
 
Для диагностики различных заболеваний и состояний выполняют исследование щелочной  фосфатазы  в сыворотке крови, в моче, в кишечном соке, в кале, а также определяют изоферменты щелочной фосфатазы: печеночный, костный, кишечный, плацентарный, изоферменты Реган и Нагайо в сыворотке крови, в амниотической жидкости.  
 
Химически щелочная фосфатаза представляет собой группу изоферментов, фосфогидролаз моноэфиров ортофосфорной кислоты, имеющих молекулярную массу от 70 до 120 кДа, гидролизующих эфиры фосфорной кислоты в интервале от 8,6 до 10,1 рН. Код щелочной фосфатазы, как фермента, КФ 3.1.3.1.

 

Щелочная фосфатаза в сыворотке крови.

 

Несмотря на наличие различных изоформ щелочной фосфатазы в тканях организма, в сыворотке крови редко одновременно обнаруживают более двух или трех изоформ. Изоформы  щелочной фосфатазы, обнаруживаемые в сыворотке крови больных с различными заболеваниями, сохраняют признаки, характерные для изоформ, находящихся в печени, костной ткани, слизистой оболочке кишечника, плаценте. В сыворотке крови здорового человека чаще всего обнаруживают печеночная и костная изоформы щелочной фосфатазы.  
 

Увеличение активности щелочной фосфатазы возможно при разнообразных заболеваниях и состояниях (патологии костной ткани с повышением активности остеобластов или распадом костной ткани, болезни Педжета, остеомаляции, болезни Гоше с резорбцией костей, первичном или вторичном гиперпаратиреоз, рахите, заживлении переломов, остеосаркоме и метастазах злокачественных опухолей в кости, циррозе печени, некрозе печёночной тка      

 

 

ни, первичной гепатокарциноме, метастатическом раке печени, инфекционных, токсических и лекарственных гепатитах, саркоидозе, туберкулезе печени,  внутрпечёночный холестазе, холангитах, камнях желчных протоков и желчного пузыря, опухолей желчевыводящих путей, цитомегалии у детей, инфекционном мононуклеозе, инфаркте лёгкого или почки, недостаточным количеством кальция и фосфатов в пище). Кроме того, причиной увеличения активности щелочной фосфатазы встречается у недоношенных, детей в период быстрого роста, у женщин в последнем триместре беременности и после менопаузы.  
 
    Также увеличивает активности щелочной фосфатазы прием различных лекарств, в том числе «гастроэнтерологических»: итоприда (ганатона), ингибиторов протонной помпы: омепразола, лансопразола и др., Н2-блокаторов гистаминовых рецепторов: ранитидина и др. (всего более 250 наименований).  
 
    Уменьшение активности щелочной фосфатазы возможно при нарушениях роста кости: при избытке витамина D и недостатке витамина С, квашиоркоре, снижении функции щитовидной железы (гипотиреоз, микседема), дефиците магния и цинка, поступающих с пищей и в старческом возрасте при остеопорозе.

Изоферменты щелочной фосфатазы.

Описано два   изофермента щелочной фосфатазы - костная щелочная фосфатаза и печеночная щелочная фосфатаза. У здорового взрослого человека костный и печеночный изоферменты присутствуют в сыворотке крови примерно в равных количествах. Однако в растущем организме – у детей и подростков – уровень костноспецифического изофермента достигает 90% от уровня общей щелочной фосфатазы.   При метаболитических заболеваниях костей общая активность щелочной фосфатазы в целом коррелирует с уровнем формирования костной ткани. Умеренное нарастание активности щелочной фосфатазы у пожилых больных может отражать нарушение минерализации или быть связанным с воздействием некоторых лекарственных препаратов, увеличивающих образование печеночных изоферментов щелочной фосфатазы. Для метаболизма костной ткани рекомендуется определять BAP . ВАР представляет собой тетрамерный гликопротеин, обнаруженный на клеточной поверхности остеобластов. Количественное определение маркера костного метаболизма ВАР дает полезную информацию о костном ремоделировании у пациентов с остеопорозом и болезнью Педжета, а также об изменениях активности заболевания под влиянием антирезорбционной терапии.  

Таким образом, по соотношению уровней маркеров резорбции и синтеза представляется возможным судить о скорости костных потерь, предсказать          

 

 

риск перелома кости, а также выбрать наиболее адекватную терапию: при высокой скорости костного оборота предпочтительны препараты, подавляющие резорбцию, а при низкой – препараты, стимулирующие формирование кости. По изменениям маркеров костной ткани в сыворотке и моче удается оценить эффективность лечения.  

 

Раздел 3.

Собственные исследования.

1. Метод определения общего кальция.

Методика:

Ионы кальция реагируют с о-крезолфталеинкомплексом в щелочной среде с образованием комплекса красно-фиолетового цвета .Оптическая плотность этого комплекса пропорциональна концентрации кальция в пробе.

Состав набора:

BUF       1×100 мл Буфер

Лизиновый буфер                            0,2 моль/л

Азид натрия                                     0,095%

RGT       1×100 мл Окрашивающий реагент

Β- гидроксинолин                             14 ммоль/л

О- крезолфталеинкомплексон           0,1 ммоль/л

Соляная кислота                                40 ммоль/л

STD        1×3 мл Стандарт кальция   

Кальций(II)                                          2 ммоль/л

Азид натрия                                         0,095%

Подготовка и стабильность реагентов:

    

 

Приготовление рабочего реагента: смешать буфер BUF  и окрашивающий реагент RGT   в равных объёмах в требуемом количестве. Дать постоять не менее 10 мин перед использованием. Не допускать загрязнения.

Измерение:

Против холостой пробы по реагенту. Нужна одна холостая проба на серию.

 

 

Схема определения:

Добавить в кюветы (мкл)	Холостая проба	Калибровочная проба	Опытная проба
Стандарт	-	20	-
Проба	-	-	20
Рабочий реагент	1000	1000	1000