Частная микробиология бактерий рода Listeria

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Оренбургский государственный аграрный университет

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Курсовая работа

На тему:

Частная микробиология бактерий рода Listeria

 

 

 

Содержание

 

Введение

История изучения

Особенности морфологии

Особенности физиологии

Антигенные особенности

Классификация и таксономия

Сходство, различия, дифференциация с близкородственными таксонами

Среды для выделения и первичной идентификации

Внутривидовая и межвидовая идентификация

Способы ускоренной индикации в объектах внешней среды и в организме животного

Медицинское и ветеринарное значение. Патогенность

Экология и распространение

Применение в практике

Заключение

Список используемой литературы

 

 

 

Введение

 

Листерии являются возбудителями острой инфекционной болезни зоонозной природы, называемой листериозом. Листериоз характеризуется множественностью путей заражения, полиморфизмом клинической картины с поражением заглоточных и других лимфатических узлов, мононуклеарной реакцией белой крови, часто с септицемией и поражением центральной нервной системы. Листерии являются аэробами, представляют собой небольших размеров грамположительные или грамвариабельные подвижные - за счёт наличия жгутиков - палочки с тенденцией к образованию цепочек из трёх, пяти и более клеток.

Целью работы явилось изучение частной микробиологии, систематики и методов идентификации бактерий рода Listeria.

Несмотря на то, что с первого установления листериоза у животных прошло более 100 лет, проблема этой инфекции привлекает все возрастающее внимание ветеринарных и медицинских работников. Это обусловлено широкой распространенностью листерий в природе, увеличением числа заболевших листериозом людей, высоким уровнем летальности при генерализированных формах инфекции, бессимптомным листерионосительством, значительным экономическим ущербом от заболеваемости и падежа сельскохозяйственных животных и затратами на профилактические мероприятия.

 

 

 

1. История изучения

 

В 1924 г. в Лондоне Марри и Иртон (Е- S. Murray, Irton), а в 1926 г. Марри, Уаоб, Суонн (Е. S. Murray, R. Webb, M. Swarm) описали микроорганизм, выделенный ими при своеобразном сепсисе, возникшем у морских свинок и кроликов в питомнике Кембриджского университета, и назвали его Bact. monocytogenes, так как введение его в кровь подопытных животных вызывало моноцитоз в крови. В 1927 г. Пири (J. H. Pirie) выделил тот же микроорганизм от крысоподобного грызуна Tatera lobengullae в Южной Африке и назвал его Listerella hepatolytica в честь Дж. Листера. Листериоз человека впервые наблюдал в 1915 г. австралийский врач Аткинсон (Б. Atkinson) в виде вспышки детского паралича. В 1918 г. Французские врачи Дюмон и Котони (J. Dumont, L. Cotoni) выделили из цереброспинальной жидкости солдата, умершего от менингита, микроб, который через 20 лет был идентифицирован Патерсоном (S. Раterson) как Listerella monocytogenes. Нифельдт (A. Nyfeldt) в 1929 г. выделил этого возбудителя при моноцитарной ангине человека. В 1935 и 1936 гг. Берн (С. Burn) описал листериоз у родильниц, новорожденных и у больного менингитом. К 1940 г. Нифельдт получил из крови и цереброспинальной жидкости больных моконуклеозом 13 штаммов возбудителя. В том же 1940 г. Пири переименовал родовое название «Listerella» в «Listeria», т. к. первое название уже было дано роду грибка Муcetozoon, и обозначил возбудителя как Listeria monocytogenes. Соответственно этому и болезнь принято называть листериозом. В СССР Л. описан сначала у свиней Т.П. Слабоспицким (1936, 1938, 1940), затем у кроликов П.П. Сахаровым и И.С. Истоминым (1940), П.И. Свинцовым (1942). П.П. Сахаров и Е.II. Гудкова 11946), А.Ф. Билибин (1949) описали листериоз у людей при менингоэнцефэлнтах (БМЭ, 1980).

 

 

2. Особенности морфологии

 

Морфологически листерии представляют собой мелкие кокковидные палочки длиной 0,5--2 мкм и шириной 0,4--0,5 мкм. Палочки слегка изогнутой формы, с закругленными концами, в препарате часто располагаются под углом друг к другу или параллельно (рис. 1). Род Listeria образуют палочковидные бактерии, образующие короткие цепочки из 3-5 клеток. В мазках из молодых S-колоний располагаются в виде палисадника либо V- и Y-образно (Поздеев, 2006).

Бактерии подвижны, имеют один или несколько (1--4) жгутиков (перитрихи) при выращивании при 20-25°С; совершают характерные «кувыркающиеся» движения. Культивирование при 37°С приводит к резкому снижению подвижности вплоть до её потери. Спор и капсул не образуют. Грамположительны, в старых культурах могут быть грамотрицательны (Тимаков, 1983).

 

Рисунок 1. Электронная микрофотография бактерий рода Listeria

 

3. Особенности физиологии

 

Листерии -- факультативные аэробы, хорошо, но не обильно развиваются на обычных нейтральных или слабощелочных (при рН 7,0--7,2) мясопептонных средах, пышно растут при добавлении в среды глюкозы или сыворотки (Тимаков, 1983).

На твердых средах при сплошном посеве листерии образуют сплошной тонкий и голубоватый налет, иногда с трудом обнаруживаемый. Культуры имеют характерный запах творога или молочной сыворотки, обусловленный накоплением продуктов углеводного обмена. Изолированные 24-48-часовые колонии мелкие (1-2 мм), больших размеров достигают на средах с глюкозой. Образуют S- и R-диссоциаты. S-колокии гладкие, резко очерченные, вьпуклые (позднее происходит их уплотнение с центральным возвышением), прозрачные, бесцветные или нежно-голубоватые, в падающем свете серовато-молочные.R-колонии шероховатые, с утолщённым зазубренным краем и возвышающейся грубозернистой массой, достигают 1,5-3 мм; S-R-переход сопровождается снижением гемолитической активности ч потерей вирулентности. В жидких средах дают равномерное помутнение, с последующим выпадением осадка, осадок слизистый, трудно диспергируемый. В полужидких средах дают рост по уколу, более обильный у поверхности (факультативный аэроб) с отходящим помутнением (особенно на глубине 3-5мм). В МПЖ некоторые 10- суточные культуры образуют перпендикулярные выросты; в желатине с глюкозой растут в виде «щёточки» или «вязанки хвороста» (Поздеев, 2006).

Оптимальная температура выращивания 37°С, может расти при более низких температурах, физиологическое развитие происходит при 18-20'С (температура оптимальна для образования жгутиков, но удлиняет срок выделения и роста культуры). Ферментативные свойства выражены слабо: они ферментируют до кислоты без газообразования глюкозу, мальтозу, рамнозу, левулезу, эскулин, салицин и непостоянно -- сахарозу, глицерин, лактозу; не образуют индол, не гидролизируют мочевину, желатину не разжижают, молоко не свертывают. Каталазоположительны, оксидазоотрицательны. Не ферментируют арабинозу, дульцит, инулин и сорбит, не образуют индола и сероводорода, не разжижают желатин, не восстанавливают нитраты в нитриты. При распаде листерий выделяется эндотоксин, экзотоксина возбудитель не продуцирует (БМЭ, 1980).

Листерии высокоустойчивы во внешней среде, растут в широком интервале температур (от 1 до 45°С) и рН (от 4 до 10), хорошо переносят низкие температуры и способны размножаться при температуре 4--6°С в почве, воде, на растениях, в органах трупов. В различных пищевых продуктах (молоко, масло, сыр, мясо и др.) листерий размножаются при температуре бытового холодильника, при 70°С погибают через 20--30 мин, при 100°С -- через 3--5 мин; инактивируются растворами формалина (0,5--1%), хлорамина (3-- 5%) и другими обычными дезинфицирующими средствами. Листерий чувствительны к пенициллином, тетрациклином, аминогликозидам, фторхинолонам нового поколения, устойчивы к цефалоспоринам (Кареткина, 2008).

Входные ворота для возбудителя-- миндалины, слизистые оболочки глаз, дыхательных путей, полости рта и кишечника, а также микротравмы кожных покровов. Возбудитель может диссемииировать по кровеносным и лимфатическим путям и проникать в различные органы и ткани, а том числе мозговые оболочки и ЦНС (Радчук, Дунаев, 1991).

Важным фактором патогенности (табл. 1) листерий является листериозин О, обладающей гемолитической активностью и определяющей вирулентность микроба; к менее значимым факторам их патогенности относятся фосфатидилиназитол, интерналин А, интерналин В, белок ActA и др. (Кареткина, 2008).

Лучше всего изучен листериозин О - порообразующий тиолзависимый гемолизин с молекулярной массой 58 кДа. Листериозин, "главный фактор" патогенности листерий, обладает выраженным токсическим эффектом при заражении лабораторных животных, вызывая их гибель. При взаимодействии с эукариотической клеткой листериозин О участвует в лизисе вакуоли (первичной и вторичной), обеспечивая свободное деление листерий в цитоплазме (Черкасский, 2002).

Металлопротеаза - полипептид с молекулярной массой около 60 кДа. Благодаря металлопротеазе неактивная форма лецитиназы с молекулярной массой 33 кДа переходит в активную форму с молекулярной массой 29 кДа.

На этапах инвазии выявлена роль нескольких поверхностных белков. Интерналин А (InlA), белок с молекулярной массой 88 кДа, участвует в инвазии эпителиальных клеток. Интерналин В, белок клеточной стенки с молекулярной массой 65 кДа, необходим для инвазии клеток гепатоцитов, но не эпителия кишечника. По-видимому, экспрессия inlA и inlB отражает специфику клеточного тропизма листерий. На этапе инвазии важную роль играет главный внеклеточный белок Р60. Это муреингидролаза, необходимая также для клеточного деления и выявляемая у всех видов рода Listeria.

Способность листерий индуировать полимеризацию актина обеспечивает возможность активного движения возбудителя по цитоплазме клеток. В этом процессе участвует поверхностный белок actA с молекулярной массой 67 кДа, индуцирующий полимеризацию актина. Гены, кодирующие известные факторы вирулентности, расположены на фрагменте хромосомы размерами около 10 тыс. пар нуклеотидов. Функционально они объединены в 4 оперона, транскрипция которых полностью (ген plcA и гены mpl - actA оперона) или частично (hly и inlAB) находится под контролем регуляторного белка PrfA. Сам ген prfA может транскрибироваться как с двух собственных PrfA-независимых промоторов, так и в составе бицистронного транскрипта, индуцирующегося на промоторе гена plcA. Это позволяет PrfA контролировать свою собственную экспрессию (Поздеев, 2006).

 

 

4. Антигенные особенности

 

Листерии имеют два типа антигена: соматический (О-Аг) и жгутиковый (Н-Аг). По структуре пяти термолабильных жгутиковых (Н-) и: четырнадцати термостабильных углеводных соматических Аг выделено 16 сероваров. Три серовара (4b, l/2b, 1/2а) вызывают 90% всех случаев листериоза человека (Радчук, Дунаев, 1991).

Листерии имеют антигенное родство со стафилококками, энтерококками, сенной палочкой и особенно с возбудителем свиной рожи (эризипелоид), что затрудняет серологическую диагностику болезни (Черкасский, 2002).

 

5. Классификация и таксономия

 

Домен: Bacteria

Филум: Firmicutes

Класс: Bacilli

Порядок: Bacillales

Семейство: Listeriaceae

Род: Listeria

Типовой вид: Listeria monocytogenes..

В определителе бактерий Берджи (1997), род Listeria включает около 7 видов: Listeria monocytogenes , Listeria welshimeri, Listeria grayi, Listeria murrayi, Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria selligeri. Только L.monocytogenes патогенна для человека и животных, а L.ivanovii - для животных. Хотя известно не менее 16 сероваров L.monocytogenes, большая часть случаев заболеваний связана с сероварами 4b, 1/2а, 1/2b.

 

 

6. Сходство, различия, дифференциация с близкородственными

таксонами

 

Дифференцирующие признаки родов аспорогенных грамположительных палочек правильной формы изложены в определителе бактерий Берджи (1997).

 

7. Среды для выделения и первичной идентификации

 

Выделение культуры и ее идентификация являются необходимыми для окончательного подтверждения диагноза листериозной инфекции. Для выделения листерий из клинического материала и продуктов питания используют селективные факторы. Наибольшее значение имеют температурный фактор и селективные добавки. Метод холодового обогащения при температуре +4^oС, основанный на психрофильности листерий, весьма эффективен, но из-за длительных сроков инкубации (10-60 дней) не может быть рекомендован для клинической диагностики. В современных схемах выделения листерий обычно используют инкубацию при температуре 30^oС в течение 24-48 ч в бульоне с селективными добавками для обогащения исследуемого образца (Тимаков, 1983).

Среди широкой гаммы селективных агентов, использовавшихся в разное время для выделения листерий, наибольшее значение сохраняют ингибиторы сопутствующей микрофлоры и дифференцирующие индикаторы: теллурит калия, налидиксовая кислота, хлорид лития, акрифлавин, эскулин, красители (фенилрот), антибиотики (цефтазидим, полимиксин B), циклогексимид (Тартаковский, 2002).

Наибольшее распространение для выделения листерий получили Оксфорд агар и PALCAM агар. В состав Оксфорд агара входят следующие селективные добавки (в г/л): эскулин - 1,0; цитрат железистого аммония - 0,5; хлорид лития - 15,0; циглогексимид - 0,4; колистин - 0,02; акрифлавин - 0,005; цефотетан - 0,002; фосфомицин - 0,01. В состав PALCAM агара входят (в г/л): эскулин - 0,8; цитрат железистого аммония - 0,5; хлорид лития - 15,0; акрифлавин - 0,005; полимиксин В - 0,01; цефтазидим - 0,02; фенилрот - 0,08 (Кареткина, 2008).

В качестве обогатительного бульона обычно используют различные варианты триптиказосоевого бульона с дрожжевым экстратом и селективным компонентом, включающим солянокислый акрифлавин (0,02-0,01 г/л), налидиксовую кислоту (0,05-0,01 г/л) и циклогексимид (0,05-0,01 г/л).

Схемы выделения листерий в зависимости от степени контаминации и количества листерий в исследуемом материале включают либо непосредственный высев на селективный агар, либо обогащение исследуемого образца на селективном бульоне при температуре 30^oС в течение 24-48 ч с последующим высевом на селективный агар (Поздеев, 2006).

На Оксфорд агаре вырастают черные колонии L.monocytogenes, окруженные черным ореолом.

На PALCAM агаре колонии листерий серо-зеленые с черным вогнутым центром (рис. 3). Для них также характерен черный ореол на красном фоне агара. Последующий анализ характерных колоний, утилизирующих эскулин (в результате чего и происходит почернение среды), позволяет на основании ограниченного числа тестов идентифицировать культуру L.monocytogenes (Черкасский, 2002).

Весьма информативен САМР-тест, в котором культура L.monocytogenes дает положительную реакцию, образуя зону усиления гемолиза с гемолитическим штаммом Staphylococcus aureus и, в большинстве случаев отрицательную с Rhodococcus equi на чашках с кровяным агаром. Для идентификации листерий в качестве дополнительных тестов используют агглютинацию с поливалентной листериозной сывороткой и фаготипирование с помощью диагностичесого набора типовых листериозных бактериофагов (L2A и L4A), лизирующих 60-80% выделенных культур листерий (Тартаковский, 2002).

 

8. Внутривидовая и межвидовая идентификация

 

Дифференцирующие признаки видов рода Listeria представлены в определителе Берджи (1997)

Особое значение имеют тесты, позволяющие идентификацию L.monocytogenes совместить с дифференциацией от других непатогенных для человека листерий (рис. 5). L.monocytogenes формирует рамнозу и не утилизирует ксилозу и маннит, обладает гемолитической активностью на кровяном агаре (Тартаковский, 2002).

Анализ серологической структуры листерий показал, что она крайне неудобна для диагностики. Серотипы листерий не являются видоспецифическими. Они могут быть общими для разных видов листерий, независимо от их патогенности для человека. В сочетании с традиционной для серологических методов исследования относительно низкой чувствительностью и специфичностью, ретроспективным характером диагностики и широким распространением бактерионосительства при листериозе этот недостаток значительно снижает область применения серологических методов. L.monocytogenes имеет одну или несколько общих антигенных детерминант с другими видами листерий, кроме L.welshimeri. Поэтому само по себе установление серотипа без применения иных методов не позволяет установить диагноз инфекции, вызванной L.monocytogenes (Черкасский, 2002).