Достижения генной инженерии и биотехнологии

В 1983г. Барбара Мак-клинток  при изучении генетики кукурузы обнаружила в ее геноме один "подвижный" ген, отвечающий за цвет початка. Независимо от нес подвижные гены были открыты  методами молекулярной генетики советским  ученым Г. П. Георгисвым. В 1981 г. процесс  выделения генов и получения  из них различных цепей был  автоматизирован.

При всем разнообразии методов  основная схема любой генно-инженерной работы остается неизменной. Она включает:

обработку кольцевой векторной  молекулы рестриктазой с образованием линейной формы ДНК;

сплавление ее с фрагментом чужеродной ДНК, ведущее к формированию гибридной структуры;

введение гибрида в  клетку реципиента;

отбор клонов трансформированных клеток на селективных средах;

доказательство присутствия рекомбинантной ДНК в этих клонах путем ее выделения из клеток, обработки соответствующими рестриктазами и анализа образовавшихся фрагментов методом электрофореза в агарозном геле.

Известно несколько методов  объединения фрагментов ДНК из разных источников, позволяющих включить клонируемую донорную ДНК в состав вектора. Один из них основан на соединении фрагментов, каждый из которых несет идентичные «хлипкие» концы, полученные под действием одной и той же рестриктазы. При другом методе, ферментативном, используется возможность соединения двухцепочных концов фрагментов ДНК с помощью ДНК-лигазы. Для повышения эффективности лигазы к концам сшиваемых фрагментов ДНК химически присоединяют комплиментарные однонитивые олигонуклеотиды, например поли-А и поли-Т, создавая тем самым искусственные «липкие» концы.

Методы введения рекомбинантных молекул в клетки зависят от особенностей самих клеток и используемых векторов. В тех случаях, когда векторами  служат плазмиды, рекомбинантные ДНК  вводят в реципиентные бактерии путем трансформации. Разработаны и методы трансформации клеток животных, а также протопластов растений. Для защиты экзогенного клеточного материала, вводимого в клетки млекопитающих или в протопласты растений, используют липосомы — сферические тельца, оболочка которых состоит из фосфолипидов. В составе липосом в клетки высших эукариот введены крупные вирусные РНК. Во всех случаях липосомы надежно защищали молекулы нуклеиновых кислот от разрушения нуклеазами.

Один из путей передачи генетической информации в культуре клеток человека, животных и растений — гибридизация соматических клеток, разработанная Б. Эфрусси и Г. Барски (1960). Эффективность этого  метода значительно повысилась после  того, как было обнаружено, что частицы  инактивированного вируса парагриппа типа Сендай увеличивают частоту  слияния клеток из самых разных источников. Показана возможность передачи генов  из изолированных хромосом китайского хомячка в клетки соединительной ткани мыши. Описаны гибриды клеток человека и мыши, из которых часть  хромосом человека удаляется, а часть  остается функционально активной. Для  введения ДНК в различные культуры клеток млекопитающих или развивающиеся эмбрионы используют метод микро иңекций ДНК в ядро с помощью микроманипулятора. Развитие методов микрохирургии клеток позволило заменять ядра оплодотворенных яйцеклеток на ядра из соматических клеток и в результате получать абсолютно идентичные организмы. Создание гибридов высших растений в обход полового скрещивания возможно путем слияния протопластов и соматической гибридизации растительных клеток, в результате чего в ряде случаев появляются целые гибридные растения. Все эти методы могут быть использованы для конструирования новых форм микроорганизмов, животных и растений путем введения и стабильного наследования в них рекомбинантных ДНК, несущих, гены, детерминирующие желаемые признаки.[4]

Следует, однако, отметить, что, несмотря на очевидные успехи подобных работ по созданию микроорганизмов, синтезирующих ряд важных продуктов  эукариотического происхождения, проблема экспрессии чужеродных генов у прокариот  имеет ряд ограничений. Некоторые  из них связаны с тем, что при  сверхпродукции полезных для человека и не нужных клетке соединений, кодируемых гибридной плазмидой, усиливается  неустойчивость самих гибридов и  вероятность элиминации из них встроенных генов. Стабильность гибридных ДНК  снижается и с увеличением размеров вставки в вектор. Поэтому разрабатываются методы, направленные на сохранение целостности гибридной структуры. Использование регулируемых промоторов предохраняет клетку от чрезмерной для нее метаболической активности, связанной с избыточной продукцией чужеродного белка. Вместе с тем проблема стабильности гибридных молекул окончательно не решена. Ограничения возможностей конструирования микроорганизмов — гиперпродуцентов ценных препаратов — распространяются на случаи клонирования и экспрессии любых генов как про -, так и эукариотического происхождения.

Наряду с этим существуют и ограничения, специфически связанные с выражением эукариотических генов в прокариотах.

Первое из них определяется тем, что эукариотические промоторы  могут не распознаваться бактериальной РНК - полимеразой.

Второе заключается в  том, что и РНК транскрибирующаяся с эукариотических генов, не содержит последовательности Шайн—Далгарно, необходимой для ее связывания с рибосомами.

В-третьих, такая иРНК может  содержать интроны, которые следует  вырезать.

Наконец, эукариотические  белки часто становятся субстратами для бактериальных протеаз, опознающих такие белки как чужеродные.[4].

Первые два ограничения  преодолеваются за счет создания векторов, несущих собственные промоторы и последовательность Шайн—Далгарно, третье можно обойти путем использования кДНК либо химически синтезированных генов. Протеазная активность реципиентных бактерий подавляется мутациями.

Преодоление всех этих ограничений  открывает дальнейшие перспективы использования методов генной инженерии при создании микроорганизмов — продуцентов гормонов, вакцин, антисывороток и ферментов, представляющих интерес для медицины, ветеринарии, сельского хозяйства и микробиологической промышленности.

Генетическая рекомбинация in vitro

Генетическая рекомбинация заключается в обмене генами между  двумя хромосомами. По определению, данному Понтекорво в 1958 г., рекомбинация—это любой процесс, способный привести к возникновению клеток или организмов с двумя или более наследственными  детерминантами, по которым их родители различались между собой и которые соединены новым способом. Такая рекомбинация обязательно происходит у млекопитающих при образовании половых клеток. В ходе мейоза гомологичные хромосомы обмениваются генами; именно эти обмены позволяют объяснить перетасовку наследственных признаков в ряду поколений. У вирусов и бактерий генетическая рекомбинация происходит реже, чем у животных. Обмен генетическим материалом, за которым следует рекомбинация, происходит между организмами одного и того же или близких видов. Все живые организмы обладают рестрикционными эндонуклеазами, которые узнают чужеродную ДНК, проникшую в организм, и расщепляют ее, таким образом сводя на нет генетическую рекомбинацию между эволюционно удаленными геномами.

Обмен генами, равно как  и введение в клетку гена, принадлежащего другому виду, можно осуществить  посредством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на кишечной палочке, в клетки которой вводили гены животных и человека и добивались их репликации.

Метод рекомбинации in vitro заключается  в выделении ДНК из разных видов, получении гибридных молекул  ДНК и введении рекомбинантных молекул  в живые клетки с тем, чтобы  добиться проявления нового признака, например синтеза специфического белка.

Выделение генов, которые  представляют собой сегменты ДНК, осуществляется на основе биохимических методов; сложность выделения зависит от величины генома. В то время как определенный ген вируса выделить относительно просто, для гена человека это очень сложная задача. Поэтому исследователи прибегают к косвенному методу, основанному на выделении информационной РНК (мРНК). В клетках животных транскрипция мРНК на ДНК осуществляется в клеточном ядре; молекулы мРНК переносят информацию из ядра в цитоплазму, где она используется при трансляции белков, аминокислотные последовательности которых закодированы в последовательностях нуклеотидов мРНК

(т. е. в конечном счете  в ДНК). В клетках бактерий (прокариот), которые не имеют ядра, транскрипция  и трансляция происходят одновременно и сопряжены; мРНК связана с рибосомами, в которых осуществляется соединение аминокислот с образованием белков. Рибосомы играют ключевую роль в трансляции и в клетках животных.

Наряду с информацией  о структуре белков (записанной с  помощью генетического кода) молекула ДНК содержит ряд регуляторных сигналов, записанных в виде специфических нуклеотидных последовательностей. Эти сигналы служат точками начала транскрипции или трансляции, другие (в частности, между генами) указывают точки прекращения считывания генетической информации. Генетический код, по-видимому, универсален для всех живых организмов, иными словами, данная последовательность ДНК обязательно кодирует один и тот же белок в клетках разных организмов, тогда как регуляторные сигналы в клетках животных и в бактериальных клетках не одинаковы. В клетках животных информация о структуре белка может кодироваться не одним непрерывным участком ДНК, а несколькими сегментами, разделенными участками ДНК, носящими название нитронов. Информационная РНК, которая транскрибируется с ДНК, подвергается расщеплению, в ходе которого все интроны удаляются из ее последовательности, а остальные остающиеся фрагменты, или экзоны, сшиваются вместе с образованием молекулы мРНК, которая обладает последовательностью, кодирующей последовательность аминокислот белка, а также содержит ругуляторные сигналы, необходимые для начала и прекращения процесса трансляции.

Для экспрессии в бактериальной  клетке гена из клетки животного необходимо, чтобы в клетку была введена молекула ДНК с последовательностью нуклеотидов, кодирующей белок, из которой интроны уже удалены; иными словами, нужна молекула ДНК, синтезированная на соответствующей мРНК обратной транскриптазой. Более того, регуляторные сигналы должны быть похожи на таковые бактериальной клетки. Наконец, для получения нужного белка в достаточных количествах бывают необходимы дополнительные изменения бактериальной клетки.[2]

Методы введения ДНК в  бактериальные клетки

Для введения ДНК (генов) в  клетки бактерий используются два метода. Первый основан на применении плазмиды в качестве вектора.

В начале 1950-х гг., вскоре после  открытия Ледербергом процесса коңюгации Escherichia coli, было установлено, что типы «спаривания» клеток бактерий обусловлены генетически и что генетическая информация переносится из клеток мужского типа в клетки женского типа, или реципиентные клетки. Способность служить донорными клетками (или фактор плодовитости F) передавалась при коңюгации значительно чаще, чем любой другой генетический признак. F-фактор передавался также независимо от любого другого известного гена донорной клетки. Ледерберг подметил, что F-фактор напоминает внехромосомные генетические элементы, имеющиеся в цитоплазме высших организмов. Это наблюдение позволило ему в 1952 г. присвоить подобным внехромосомным генетическим системам общее название—плазмиды.

В 1953 г. Хэйс, который в  то время работал в больнице Хаммерсмита  в Лондоне, установил, что в определенных условиях F-фактор может оказаться  сцепленным с генетическими маркерами и индуцировать последовательный их перенос в ходе коңюгации. F-фактор присоединяется к бактериальной хромосоме в специфическом участке (сайте); именно в этой точке хромосома разрывается при коңюгации и начинается ее перенос в реципиентную клетку. F-фактор способен также отделяться от хромосомы, захватывая подчас небольшие фрагменты хромосомы; поэтому его можно рассматривать как виехромосомный элемент, который иногда интегрирует в хромосому.

Жакоб и Вольман, сотрудники Института Пастера в Париже, отметили сходство в поведении F-фактора, умеренного бактериофага X, и другой плазмиды—Со1Е1 (которая кодирует колицин—белок, убивающий клетки Е. coli ). Для обозначения генетического элемента, который может реплицироваться либо в свободном состоянии, либо соединившись с бактериальной хромосомой, они предложили новый термин—«эписома».

В 1959 г. в Японии при исследовании больных бактериальной дизентерией, которые не поддавались лечению обычно эффективными антибиотиками, было сделано замечательное открытие. В клетках патогенных бактерий (Shigella dysenteriae) были найдены гены, придававшие им устойчивость одновременно к нескольким антибиотикам; такая устойчивость передавалась другим кишечным бактериям во многом подобно тому, как передается F-фактор. Эти факторы устойчивости (называемые R-факторами) обладали сходством с F-фактором; так, они были способны индуцировать передачу самих себя от клетки к клетке при коңюгации. Позже удалось показать, что некоторые из них содержат последовательности нуклеотидов, близкие к таковым F-фактора.

В начале 1960-х гг. Новик  обнаружил подобные факторы устойчивости у стафилококков; они содержали ген, кодирующий фермент пенициллин-β-лактамазу, или пенициллиназу; последняя расщепляет пенициллин и таким образом обеспечивает устойчивость к этому антибиотику. R-факторы стафилококков, по-видимому, не способны обеспечивать передачу самих себя посредством коңюгации и переносятся лишь пассивно в процессе трансдукции, т. е. при их встраивании в ДНК бактериофага. Это открытие указывало на наличие нескольких R-факторов в клетках кишечных бактерий.

К середине 1960-х гг. стало  очевидным, что большинство R-факторов кишечных бактерий и стафилококков (как и плазмида Со1Е1) отличаются от F-фактора и фага λ [И.С.1]тем, что остаются внехромосомными элементами; их обратимого встраивания в хромосому клетки не происходит. В строгом смысле они не соответствовали определению эписомы. В 1963 г. Новик предложил пользоваться предпочтительно термином «плазмида», как более общим, а не «эписома». В настоящее время термин «плазмида» является общепринятым.

Плазмиды найдены почти  у всех видов бактерий. Штамм, содержащий плазмиду, способен давать начало вариантам, у которых плазмида утрачена; в  подобных случаях плазмида теряется окончательно, клетка не способна ее регенерировать и может только получить ее из другой бактериальной клетки.

Плазмиды представляют собой  кольцевые молекулы ДНК, по размеру  соответствующие 1—3% генома бактериальной клетки, однако даже столь малая часть наследственного аппарата кодирует важные генетические признаки, которые обычно сама бактериальная хромосома не кодирует. Например, они содержат информацию, необходимую для коңюгации бактериальных клеток, ими обусловлен ряд заболеваний растений и животных. Они позволяют клеткам использовать многие сложные соединения в качестве источников питания и обеспечивают устойчивость к разнообразным токсичным агентам, особенно к антибиотикам. Плазмиды стафилококков несут гены устойчивости к пенициллину, соединениям ртути и ряду тяжелых металлов, вызывающих летальный эффект (солям сурьмы, висмута, кадмия и свинца, ионам арсената и арсенита). Гены устойчивости к тяжелым металлам обнаружены также в составе R-плазмид Е. соli. Наличием плазмид обусловлены также некоторые заболевания с выраженной диарреей, стафилококковый импедиго, створаживание молока и превращение его в сыр молочнокислыми бактериями, а также разнообразные биохимические реакции, характерные для бактерий рода Pseudomonas.. Плазмиды могут управлять синтезом инсектицида в клетках Bacillus thuringiensis [2]. Использование плазмид в качестве векторов для введения чужеродных генов в бактериальные клетки начиная с 1975 г. послужило толчком для интенсивных исследований их структуры и характера репликации.