Фактори росту ендотеліальних клітин (vegf): реалізація мітогенного сигналу через специфічні рецептори

Судинне русло пухлини  з морфологічної точки зору є  вкрай атиповим і становить значну частину пухлинної строми. Макроскопічно виявляються два загальних типи периферичної та центральної судинної перфузії. У центрі пухлин з периферичною судинною мережею є великі ділянки некрозу, в пухлинах з центральним типом судинного русла - малі. Однак ці фенотипи всередині пухлини багато в чому перекриваються, причому в одній частині пухлини може бути будь-який з цих двох типів кровопостачання. Крім того, багато судин пухлини знаходяться в сплячому стані через недостатню механічну підтримку навколишньою стромою. Мікроскопічно судини виглядають розширеними, звитими, виявляється наявність сліпих петель і виростів, шунтів і нечисленних анастомозів [5].

Пухлинні кровоносні судини не вистелені звичайним монослоєм ендотеліальних клітин, а є дезорганізованими, пухкими і безладно пов'язаними один з одним. У багатьох кровоносних судинах пухлини також мають ендотеліальні вирости з просвіту, які проникають глибоко в периваскулярну строму. Оскільки клітини ендотелію не утворюють нормального моношару, вони не можуть виконувати звичайну бар'єрну функцію ендотелію, що грає роль в аномально високій проникності цієї судинної мережі та її схильності до кровотеч. Великі концентрації VEGF є потужним чинником, що підвищує проникність [6].

Нещодавно основним показником активності ангіогенезу в пухлинах була мікроскопічна оцінка щільності  судин у тканині самої пухлини, але за останнє десятиліття в  результаті дослідження молекулярних механізмів пухлинного ангіогенезу  була виявлена група регуляторних ангіогенних  і антиангіогенних факторів, що забезпечують формування нових судин всередині  пухлини [4, 5, 6]. Мабуть, механізм такої адаптивної відповіді в тому, що відносний недолік кисню приводить до підвищення ангіогенних стимулів. Паракринний механізм впливу ангіогенезу полягає у дії на ріст судин в тканинах з низьким рівнем перфузії. Цікавий факт, що не відбувається індукції VEGF в культивованих клітинах гліоми, позбавлених і кисню, і глюкози. Підвищення експресії VEGF вимагає синтезу білка, який не може йти при подвійному стресі. Здатність реагувати на гіпоксію та гіпоглікемію дає перевагу в ситуації, коли існує дефіцит тільки одного з метаболітів.

 

 

 

 

 

 

 

 

РОЗДІЛ 3 ГРУПА МОЛЕКУЛ І РЕЦЕПТОРІВ VEGF

 

VEGF-гомодимерний, сильно гліколізований білок, мітогенний тільки для ендотеліальних клітин, рівень його підвищується в тканинах, де активно відбувається васкуляризація, його рецептори експресуються на ендотеліальних клітинах-мішенях в довколишніх кровоносних судинах. Основними біологічно активними формами є молекули розміром 121 і 165 амінокислотних залишків. Ангіогенез функціонує в динамічному поєднанні з цитокінами, їх розчинними рецепторами і антагоністами, протеолітичними ферментами, які регулюють їх звільнення з позаклітинного матриксу [7].

Група VEGF включає прототипну молекулу VEGF-A, а також VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, вірусний гомолог VEGF-E і плацентарний ростовий фактор (PLGF). VEGF-A підвищує судинну проникність і сприяє васкуляризації, VEGF-B відіграє роль в регуляції деградації позаклітинного матриксу, клітинної адгезії та міграції, аVEGF-C і VEGF-D беруть участь, головним чином, в лімфангіогенезі. PLGF у великій кількості експресується тромбобластом, модулюючи розвиток судинної сітки в плаценті (рис. 3.1).

VEGF впливає на розвиток  нових кровоносних судин, зв'язуючись  із двома близькими за будовою  мембранними тирозинкіназними рецепторами  (VEGFR-1 і VEGFR-2) і активуючи їх. Ці рецептори експресуються клітинами ендотелію стінки кровоносних судин. VEGF ліганд запускає сигнальний каскад, який в кінцевому підсумку стимулює зростання ендотеліальних клітин судини, їх виживання і проліферацію.

VEGFR-1, VEGFR-2 виражені в клітинній поверхні більшості кров’яних ЕК. В той час як, VEGFR-3 в основному обмежується лімфатичними ЕК.  VEGF-A зв'язується як VEGFR-1, VEGFR-2. VEGF-C і VEGF-D зв'язують VEGFR-2 і VEGFR-3. VEGFR-2 є основним медіатором EК мітогенезу та виживання, а також ангіогенезу і проникності капілярів. На противагу цьому, VEGFR-1 не передає ефективного мітогенного сигналу в ЕК, і це може, особливо під час раннього ембріонального розвитку, виконати інгібуючу роль ізолюючи VEGF і запобігання його взаємодії з VEGFR-2. Така роль «приманки» може бути також виконана розчинним VEGFR-1, утвореного шляхом альтернативного сплайсингу. Тим не менш, VEGFR-1 має встановлену сигнальну роль в посередництві хемотаксису моноцитів. Крім того, в кровотворних стовбурових клітинах (HSC) або лейкозних клітинах, таких як VEGFR-1 і VEGFR-2 може створюватись хемотаксичний сигнал і сигнал виживання (R1,VEGFR-1, R2, VEGFR-2, R3, VEGFR-3).

 

Табл. 3.1 Рецепторна специфичність лігандів VEGF і їх біологічні ефекти

 

Ліганд	Рецептор	Функція
VEGF (VEGF-A)	Рецептори-1, -2, VEGFR, нейропілін-1	Ангіогенез, судинна підтримка
VEGF-B	VEGFR-1	Невідома
VEGF-C	VEGFR-2, VEGFR-3	Лімфангіогенез
VEGF-D	VEGFR-2, VEGFR-3	Лімфангіогенез
VEGF-E (Вирусный фактор)	VEGFR-2	Ангіогенез
PLGF	VEGFR-1, нейропілін-1	Ангіогенез і запалення

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 3.1 Група молекул і рецепторівVEGF

 

 

Зв’язування VEGF з рецептором VEGFR-2 веде до активації каскаду різних сигнальних шляхів. Приклади двох з них зображені на рис. 3.1. Така взаємодія призводить до включення генів, що втягуються в опосередкування процесів проліферації та міграції клітин ендотелію, і забезпечує клітинне виживання, а також судинну проникність. Наприклад, зв'язування VEGF з рецептором VEGFR-2 призводить до димеризації рецептора, за яким відбувається активація:

- PLC (phospholipase C – фосфоліпаза C) є частиною G-білок-зв'язаного сигнального шляху або частиною трансмембранного рецептора з внутрішньою чи асоційованою тирозинкіназною активністю. VEGF-активація протеїнкінази С стимулює фосфорилювання і сприяє проникності ендотелію.

- PKC – протеїнкінази С. Ser/Thr-специфічна протеїнкіназа експресується практично у всіх клітинах ссавців. Її субстратами в різних клітинах служать ядерні білки, білки цитоскелету, ферменти. РКС є під мембранним білком. Вона складається з двох доменів: гідрофобного (N-кінцевого), який закріплює ферментна мембрані, і гідрофільного, що містить каталітичний центр.

- Raf – кінази, серин-треонінової специфічності;

- MEK – кінази, активується присерин/треоніновому фосфорилюванні, MEKє кіназою подвійноїспецифічністі, яка фосфорилює залишкитирозину ітреоніну;

- MAPK – міоген-активованої протеїн – кінази.

  МАРК–каскади реакцій фосфорилювання протеїнкіназ та інших регуляторних білків забезпечують покрокове декодування первинних ефекторних сигналів шляхом їх передачі від поверхні клітин до ядра або іншим внутрішньоклітинним компонентам, що завершується наступною ініціацією синтезу ДНК і росту клітин.

Активована RAF-кіназа (серин-треонінової специфічності) фосфорилює і активує МЕК, іншу серин-треонінову кіназу. МЕК фосфорилює і активує МАРК. Ця серія активації є прикладом каскаду протеїнкіназ. Один з ефектів активації МАРК – це зміна трансляції мРНК. МАРК фосфорилює і активує S6 кіназу 40S рибосомних білків (RSK). RSK фосфорилюють рибосомний білок S6, і викликає його дисоціацію від рибосоми. МАРК також регулює активності декількох транскрипційних факторів, наприклад, C-myc. МАРК регулює активність генів, що контролюють клітинний цикл [8].

З іншого боку активація  фосфатидилінозитол 3' - кінази (PI3K) - Akt шляху призводить до збільшення зростання виживання ендотеліальних клітин.

Akt, також відомий як протеїнкіназа-В (РКВ), являє собою серин/треонін- специфічну протеїнкіназу яка грає ключову роль в різних клітинних процесах, таких як метаболізм глюкози, апоптоз, проліферація клітин, транскрипція і міграція клітин.

Активація гена src (група протоонкогенних тирозинових кіназ, знайдена Майклом Бішопом і Гарольном Вармусом в 1980 році) може спричинити зміни актину цитоскелета та індукувати міграцію клітин. Рецептори VEGF локалізовані на поверхні клітин ендотелію, проте можуть бути присутніми також і внутрішньоклітинні («інтракринні») VEGF-сигнальні рецептори (VEGFR-2). Вони залучаються до процесів забезпечення виживання ендотеліальних клітин. Детальна структура внутрішньоклітинного VEGFR-2 до цих пір не відома, але в науковій літературі [4, 5, 8] він показаний як повнорозмірний рецептор, який в нормі прикріплений до поверхні клітини. VEGF може приєднуватися до рецепторів нейропіліну (NRP), які можуть діяти як корецептор з VEGFR-2 (горизонтальна стрілка) і здійснювати регуляцію ангіогенезу. Нейропілін є білковим рецептором у нейронах. Існують дві форми нейропілінів - NRP-1 і NRP-2 – це трансмембранні глікопротеїни і переважноко-рецептори для іншого класу білків, відомих як семафоріни, відповідальні за аксони при розвитку нервової системи у хребетних.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

РОЗДІЛ 4 РОЛЬ VEGF РЕЦЕПТОРІВ У РІЗНИХ ТИПАХ КЛІТИН

 

VEGF рецептори позаклітинної частини складаються з семи імуноглобулін-подібних доменів, одного трансмембранного регіону і внутрішньоклітинної частини, що містить розчинний домен тирозинкінази.

VEGFR1 є позитивним регулятором  міграції моноцитів та макрофагів, а також позитивної і негативної  регуляції VEGFR2 сигналізації. Негативне  регулювання здійснюється, принаймні  частково, шляхом альтернативного  сплайсингу розчинного варіанту VEGFR1, який зв'язується з VEGF і  тим самим запобігає зв’язуванню  VEGF з VEGFR2. VEGFR2 бере участь у  всіх аспектах життєдіяльності   ендотеліальних клітин. Останнім  часом пухлинна терапія ґрунтується на нейтралізуванні анти-VEGF антитіл і невеликої молекулярної маси тирозин-кіназних інгібіторів [2]. 

VEGF-A відіграє важливу роль в утриманні ендотеліальних клітин новоутворених кровоносних судин до моменту приєднання до них перицитів (сполучнотканинних клітин, що беруть участь у синтезі елементів базальної мембрани та позаклітинного матриксу) [5].

Цікаво, що рецептори VEGF також експресуються пухлинними клітинами, в тому числі VEGFR-1 виявляється в ракових клітинах. Це дозволяє припустити, що анти-VEGF-терапія може надавати і інші ефекти, окрім пригнічення ангіогенезу.

VEGF-C і VEGF-D теж зв'язуються з рецептором VEGF-2, а також з рецептором VEGF-3. Отже, якщо VEGF-A (домінуючий всередині пухлини) буде нейтралізований, сигнальні шляхи, опосередковані VEGF рецептором-2, можуть бути активними в тому випадку, якщо пухлина продукує значну кількість VEGF-C і VEGF-D. Дійсно, рівні експресії VEGF-C і VEGFR-2 в первинних пухлинах ободової кишки і метастазах в лімфатичних вузлах дозволяють припустити наявність сигнального шляху VEGF-C [5]. VEGFR-1 зв'язується з VEGF-A, VEGF-B і PIGF, але його точні функції не з’ясовані. Крім мембранно-зв'язаної форми, існують також чотири розчинні ізоформи, що блокують VEGF-A шляхом конкурентного зв'язування, і тим самим запобігають його взаємодії із VEGFR-1 і VEGFR-2. Ліганд, що зв'язується з мембрано-зв'язаною формою VEGFR-1, викликає лише слабке автофосфорилювання тирозинкінази. З цієї причини припустили, що VEGF рецептор-1 є приманкою-рецептором, бере участь у негативній регуляції мітогенного сигналу як у мембрано-зв'язаної, так і в розчинній формах. Подальші докази такої ролі були отримані при додаванні PLGF, який конкурує з VEGF-A за VEGFR-1 і потенціює ефекти VEGF-A. Присутність PLGF підвищує доступність VEGF-A для зв'язування з рецептором VEGF-2, в результаті чого виникає сильний мітогенний сигнал.

Третій рецептор VEGF - VEGFR-3, не зв'язується з VEGF-A і виявляється, головним чином, в лімфатичному ендотелії. VEGF рецептор-3 зв'язується з VEGF-C і VEGF-D і бере участь в основному в лімфангіогенезі [5].

 

Рис. 4.1 Роль VEGF рецепторів у різних типах клітин

 

 

Матрична металопептидаза 9 (ММР-9) являє собою фермент, який у людини кодується геном ММР9.

Білки матричної металопептидази - беруть участь у розкладанні позаклітинного матриксу в нормальних фізіологічних процесах, таких як ембріональний розвиток, розмноження, і ремоделювання тканини, так і в патологічних процесах, таких як артрит, внутрішньо мозковий крововилив [2], іметастазування. Більшість металопептидаз декретуються як неактивні про- протеїни, які активуються, коли розщеплюються позаклітинні протеїнази. ТPA –тканинний активатор плазміногену - білок, що відноситься до групи протеаз, що перетворюють профермент плазміногену в активну форму - плазмін, який є фібринолітичним ферментом. Синтезується у вигляді одного ланцюга амінокислот, що з’єднується з плазміногеном за допомогою дисульфідних містків. Бере участь у процесах ре моделювання тканин іміграції клітин. Гіперактивація ферменту призводить до підвищеної кровоточивості, знижена активність до пригнічення процесів фібринолізу, що може призвести до тромбозів і емболій.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

РОЗДІЛ 5 ІЗОФОРМИ VEGF ТА САЙТИ ФОСФОРИЛЮВАННЯ

 

VEGF-A проходить альтернативний сплайсинг, що призводить до появи різних ізоформ, що позначають VEGFxxx (xxx означає кількість амінокислотних залишків, присутніх в білках без сигнального пептиду).

У людини виділені 4 ізоформи VEGF-A: VEGF₁₂₁, VEGF₁₆₅, VEGF₁₈₉ і VEGF₂₀₆, які утворюються в результаті альтернативного сплайсингу мРНК VEGF.

Ізоформи, які мають подібну  біологічну активність, але сильно розрізняються за біодоступністю, що визначається розміром молекули і регулюється  на генетичному рівні при альтернативному  сплайсингу мРНК [6].

Біологічні ефекти VEGF визначають рецептори тирозинкінази (RTK), VEGFR-1 і VEGFR-2, які значно відрізняються за властивостями сигналізації. Несигнальні корецептори також модулюють VEGF RTK сигналізацію [2].

 

Рис. 5.1 Ізоформи VEGF та їх взаємодія з рецепторами VEGFR-1, -2.

 

 

У відповідь на різні стимули, дифундуючі ізоформи VEGF (VEGF₁₂₁ і VEGF₁₆₅) виділяються різними нормальними і трансформованими клітинами, і можуть зв'язуватися з VEGFR-1 і VEGFR-2. VEGF₁₆₅ (але не VEGF₁₂₁) взаємодіє з нейропіліном-1 і -2.   Плазмін та молекулами позаклітинного матриксу (ПКМ) руйнується, VEGF₁₈₉ розщеплюється на СООН-кінці, а отриманий 110-aminoacid NH2 – кінцевий фрагмент – дифузно- і біоактивний [3].