Фізіологія рослин на сучасному етапі розвитку

3. Методи фізіології  рослин 

3.1. Основні методи дослідження

Методологія фізіології рослин заснована на уявленнях про рослинний організм як складну саморегулюючу систему, з ієрархією різних структурних рівнів – від субклітинних (макромолекул) до цілісної рослини. Методами фізіології та біохімії рослин є лабораторні та польові дослідження, а також культура клітин і тканин. Вони включають вивчення фізіолого-біохімічних процесів клітин, водообміну, дихання, вуглецевого та мінерального живлення рослин, процесів синтезу, транспорту, перетворення та нагромадження органічних сполук, фізіологічних особливостей онтогенезу та стійкості рослин до несприятливих факторів навколишнього середовища, а також взаємодії з іншими організмами.

Проблеми та завдання фізіології рослин настільки широкі та складні, що вирішення їх потребує застосування цілого комплексу тонких фізико-хімічних методів, різноманітних експериментальних та теоретичних підходів. У фізіологічних дослідженнях користуються трьома основними методами: аналітичний або описовий (спостереження та порівняння), синтетичний (експериментальний), історичний. Щоб пізнати життя рослин, слід  насамперед проаналізувати всі окремі прояви її життєдіяльності, детально вивчити ті фізичні та хімічні явища, які лежать в основі життєвих процесів. Це забезпечує аналітичний метод дослідження. Це найбільш давній метод. Особливого значення цей метод набуває при порівнянні змін фізіологічних процесів, що відбуваються під впливом різних умов вирощування рослин.

Пізнавши окремі складові частини, необхідно вивчити життєдіяльність цілого рослинного організму. Синтетичний метод  визначає ступінь досконалості фізіологічних досліджень. Впровадження синтетичного методу призвело до виникнення фізіології окремих культур, прикладної фізіології. Поряд із синтетичним методом стоїть історичний. Пізнання історичного розвитку, тобто філогенезу дає можливість правильно розуміти розвиток кожної істоти протягом її індивідуального життя – онтогенезу.

Почавши свій розвиток як наука про ґрунтовому живленні рослин, фізіологія рослин після відкриття фотосинтезу, а також законів збереження матерії та енергії все більше включала в полі свого зору повітряне середовище і світло як основні матеріальні і енергетичні джерела існування рослин.

Аж до початку 20 сторіччя дослідження фізіологічних процесів здійснювалися головним чином аналітичними, кількісними методами. Так, критеріями при вивченні процесів фотосинтезу служили кількість асимільованої CO2, виділеного O2. В роботах по диханню увага концентрувалася на визначенні поглиненого O2 і виділилася CO2. В роботах по кореневому харчуванню вивчалося кількість поглинених мінеральних елементів, вплив на ці процеси вмісту в ґрунті неорганічних і органічних сполук і т.д.

Однак протягом ряду десятиліть дослідження процесів ґрунтового живлення проводилися поза зв'язку з процесами повітряного живлення, процеси обміну речовин відривалися від процесів обміну енергії. У такому ж становищі перебували і роботи в області експериментального формоутворення, при проведенні яких зазвичай залишалися без уваги процеси обміну речовин і енергії. Вирушаючи від еволюційної теорії Ч. Дарвіна, К. А. Тімірязєв постійно підкреслював існування взаємозумовленості і нерозривному зв'язку між усіма процесами, що протікають в живій рослині, необхідність комплексного і всебічного їх вивчення. Здатність рослин, позбавлених постійного внутрішнього середовища, розвиватися в безперервно змінних умовах зовнішнього середовища досягається закономірними і строго регульованими змінами обміну речовин, які виникають в рослинах у відповідь на впливу, що надходять із зовнішнього середовища. Оскільки умови середовища в ході еволюції змінювалися, то розкрити властивості вигляду можна, лише ставши на історичну точку зору. Тільки постійне поєднання експериментального й історичного методів може забезпечити успішний розвиток фізіології рослин. Ця ідея була вперше сформульована Тімірязєвим в книзі "Історичний метод в біології" (1922).

У першій половині 20 в. Ф. р. все більш зміцнює свої зв'язки з біохімією і біофізикою, все більш широко використовує фізико-хімічні методи - різні види спектрального аналізу і мас-спектрометрії, електронну і ультрафіолетову мікроскопію, диференціальне центрифугування, хроматографію, метод ізотопних індикаторів і ін. За допомогою цих методів, що дозволяють вести дослідження на клітинному і субклітинному рівнях, включаючи молекулярний, фізіологія рослин збагатилася принципово новими даними про природу механізмів, регулюючих всю складну сукупність процесів життєдіяльності рослин, їх функціонування як єдиних, цілісних систем. Прогресу фізіології рослин сприяло створення (починаючи з середини 20 в.) спеціальних приміщень штучного клімату - фітотронах.

При дослідженні складних біологічних явищ сучасної фізіології рослин широко використовує моделі простіших, складових їх ланок. Такі моделі дозволяють відкривати нові закономірності поглинання і асиміляції неорганічних речовин і води, поглинання, перетворення та запасання сонячної енергії, подальшого використання енергії в процесах біосинтезу, росту, розвитку, руху рослин і т.д. Вирушаючи від вивчення систем і процесів на молекулярному і субклітинному рівнях, фізіологія рослин включає в поле зору клітку, органи, організм і, нарешті, різні види співтовариств - фітоценози, біоценози, біогеоценози. Використовуючи ці методи і підходи, дані інших наук, сучасна фізіологія рослин в широкому сенсі вирішує 2 основні завдання: вивчення рослинного організму як системи взаємодіючих елементів (морфологічних і фізіологічно активних компонентів) протоплазми і вивчення взаємодії рослинного організму з біологічними і фізико-хімічними умовами зовнішнього середовища (діапазон мінливості функцій організму, його здатність підтримувати непорушеним властивий йому обмін речовин, природа систем, що визначають характер реагування організму на вплив зовнішніх факторів, і ін.).

Результати досліджень в зазначених напрямках мають значення для вирішення таких важливих практичних с/г задач, як акліматизація, інтродукція, селекція, гібридизація, отримання гетерозисних форм, районування сортів, розміщення с/г рослин, а також при проведенні заходів з агротехніки, удобрення, штучному зрошенню і ін.

3.2. Сучасні методи  вивчення клітини

Нині існує безліч методів вивчення рослинних клітин. З них найбільш широко використовуваний – класичний мікроскопічний метод, що полягає у вивченні живих і фіксованих клітин і тканин на тимчасових і постійних препаратах за допомогою звичайних світлових мікроскопів. Вирішальна здатність світлового мікроскопа складає приблизно 500 нм. Тоншу структуру клітини виявляють за допомогою електронного мікроскопа, який забезпечує збільшення у 100 разів вище, ніж у світлового

Широко використовуваним методом в електронній мікроскопії є метод “за- морожування – сколювання”. При цьому заморожену тканину (–196 °С) роз- колюють лезом і площина відколу в багатьох випадках проходить через гідро- фобну зону мембран, що дозволяє по-новому глянути на мікроструктури клітин і установити положення окремих макромолекул. Для вивчення хімічного складу і функцій окремих клітинних структур з успіхом застосовуються методи фракціонування клітин чи їхнього вмісту. Екстракти зруйнованих клітин ділять на фракції, піддаючи їх високошвидкісному центрифугуванню. Крупні компоненти екстракту осідають першими (ядра, хлоропласти, мітохондрії). При підвищенні швидкості центрифуги осаджуються дрібніші органели (мікросоми, рибосоми й ін.). Швидкість седиментації (від лат. – sedimentum – осідання) кожного компоненту залежить від його розмірів і форми, і звичайно виражається коефіцієнтом седиментації – S (Сведберг) на честь шведського фізика Теодора Сведберга, який розробив даний метод. Коефіцієнт седиментації виміряється в секундах (1S = 1 · 10 с). Таким чином, чим вищий коефіцієнт, тим більша маса чи частка молекули. Так, наприклад, розміри і типи рибосом позначають че- рез коефіцієнт седиментації – 70S-рибосоми (дрібніші), 80S-рибосоми (крупніші). Виділення органел чи інших субклітинних компонентів можливе не тільки за до- помогою центрифугування. Для вивчення функціональної активності різних компонентів клітини іноді використовують методи мікрохірургії. В таких експериментах за допомогою мікроманіпуляторів різної конструкції проводять операції по вилученню тих чи інших органоїдів клітини і їх трансплантації в інші клітини. Великі можливості у вивченні фізіології клітини відкрилися з розвитком методів генної інженерії і біотехнології. Вони дозволили ефективно прослідковувати процеси формування клітинних оболонок, вакуоль, диференціацію анатомічних елементів і закономірність їх утворення в онтогенезі. Подібні методи використовуються не тільки дослідниками клітин. Так, технології рекомбінантних ДНК у прикладних галузях дозволяють створювати трансгенні організми з новими властивостями й ознаками, необхідними людині.

Розвиток фітофізіології, як і будь-якої іншої науки, залежить не лише від нових ідей, а й від нових методологій. Як відомо, більшу частину знань у галузі біології рослин здобуто з використанням методів, котрі дозволяли одержувати лише дискретну інформацію про їх життєдіяльність. Однак фізіологічні функції та біохімічні реакції метаболізму здійнюються переважно в нелінійному, осцилюючому режимі. Тому для з’ясування їхнього механізму застосовують сучасні методи (інфрачервону спектроскопію, радіоактивні та стабільні ізотопи, ЯМР- та позитрон-емісійні томографи, флуоресцентні зонди тощо), за допомогою яких можливо реєструвати просторово-часові параметри метаболічних процесів без руйнування цілісності організму. Останнім часом нові знання про механізми процесів, що відбуваються в рослині, накопичуються дуже швидко завдяки впровадженню сучасних методів молекулярної біології, генної та клітинної інженерії у комбінації з класичними і фізіологічними. Такі методи дозволяють досліджувати динаміку метаболічних циклів рослинного організму в реальному часі без ушкодження клітини.

У різних напрямках біології рослин широко запроваджуються новітні молекулярно-біологічні методи вивчення експресії значної кількості індивідуальних генів, фізіології генетично модифікованих організмів. Розроблено технології одержання трансгенних рослин із заданими властивостями — наприклад, «золотий рис», в якому синтезується і накопичується провітамін А. У зв’язку з появою нового типу — генетично модифікованих організмів значно розширилися методичні можливості для проведення фундаментальних досліджень із трансгенними рослинами. Тому значну увагу звернуто на фізіологію трансгенних рослин, їх одержання та практичне застосування генетично модифікованих форм. Трансгенні рослини вже займають десятки мільйонів гектарів, замінюючи своїх натуральних попередників, тому необхідне детальне вивчення всіх особливостей метаболізму таких організмів.

Крім методів генної інженерії великі можливості для створення нових різноманітних форм рослин відкриває використання клітинних технологій. Вже розроблено методи, які дозволяють керувати властивостями унікальної експериментально створеної білогічної системи — популяції рослинних соматичних клітин in vitro (наприклад, за рахунок внесення до культурального живильного середовища регуляторів росту). Система in vitro дає змогу вивчати клітинні та молекулярні основи морфогенезу. Дослідження генетичного контролю морфогенезу in vitro має надзвичайно велике значення для розвитку і вдосконалення різноманітних фітобіотехнологій. Біологічні системи in vitro є дуже перспективними для збереження генофонду цінних біоресурсів, зокрема кріобанків для депонування найцінніших культурних і дикорослих видів.

4. Напрями сучасної фітофізіології

Завдання фізіології рослин як науки - дослідження процесів метаболізму, росту і розвитку рослин, з'ясування механізмів цих процесів і взаємозв'язків між ними. Фізіологія рослин охоплює все коло процесів, що відбуваються в рослинному організмі, і відповідно підрозділяється на ряд напрямків:

• основі цих напрямків лежить вчення про рослинній клітині, особливостях її структури та функціонування, а так же про механізми сприйняття і передачі сигналу в рослині;
• ряд напрямків фізіології рослин присвячений дослідженню окремих процесів обміну речовин у рослин. Це такі розділи, як фотосинтез, дихання, водний обмін, мінеральне живлення і вторинний метаболізм. Фізіологія росту і розвитку рослин вивчає механізми росту і диференціювання клітин, тканин і органів, механізми розмноження рослин, а також механізми їх регуляції факторами зовнішнього середовища, такими як світло, температура і т.п .;
• окремим напрямком можна виділити вивчення механізмів руху рослин;
• фізіологія стійкості рослин досліджує механізми, за допомогою яких рослини захищаються від дії несприятливих чинників середовища, як біотичних (патогенні бактерії, гриби, віруси), так і абіотичних (посуха, засолення, підвищені та знижені температури, надлишок сонячного світла);
• напрямок культура клітин рослин. Він присвячений дослідженню поведінки рослинних клітин і тканин в культурі in vitro, розробці методів їх вирощування та відповідних біотехнологій (мікроклональне розмноження рослин, виробництво ліків і харчових добавок тощо).

Напрями, присвячені дослідженню обміну речовин рослин, такі як фотосинтез, дихання і мінеральне живлення, також мають прямий практичний вихід в сільське господарство. Вони дозволяють розробити нові ефективні добрива та регулятори росту, вивести більш продуктивні сорти рослин.

В основі всіх напрямків сучасної фізіології рослин лежать біохімічні, біофізичні, молекулярно-біологічні методи дослідження.

У класичній фізіології рослин розрізняють 6 принципово важливих напрямків:

4.1. Біохімічний напрям

• розглядає функціональне значення різноманітних органічних речовин, які утворюються в рослинах у процесі фотосинтезу, дихання; (В. Пфеффер,

Ж. Буссенго, К. А. Тімірязєв, В. І. Палладін, Л. Пастер)

• виявляє закономірності мінерального живлення рослин, шляхи біосинтезу органічних сполук з найпростіших мінеральних речовин (вуглекислий газ, вода, аміак, нітрати, сірчана і фосфорна кислоти, магній, кальцій, калій, мікроелементи); (Й. Кноп, С. М. Виноградський, Д. М. Прянишников)