Генная терапия

План

1. Генная терапия
2. Методы генетической трансфекции в генной терапии.
3. Моральные проблемы генной терапии.
4. Принципы и лечения наследственных болезней.
5. Список использованной литературы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

 

Успехи в изучении молекулярных основ наследственных болезней расширили  возможности точной диагностики  моногенных болезней. Понимание патогенеза наследственных болезней развивается медленнее, в основном из- за того, что прогресс в этой области часто требует знания процессов, охватывающих организм в целом, - а их невозможно изучать в классическом остром эксперименте. Большие надежды возлагаются на развитие неинвазивных методов исследования метаболизма, таких, как позитронно-эмиссионная томография и локальная магнитно-резонансная спектрометрия, а также на новые генетические подходы к получению биологических моделей наследственных болезней человека.

 

Эмпирические попытки лечить больных  с наследственной паталогией, предпринимаемые в течение 200 лет вплоть до 30-х годов ХХ в., не дали положительных результатов. Диагноз наследственной болезни оставался как приговор обреченности больному и его семье, а такие семьи считались вырождающимися. Эта позиция в медицине в первые десятилетия ХХ в. опиралась, по-видимому, также на генетическую концепцию об очень строгой детерминации менделирующих наследственных признаков. В связи с этим в начале ХХ в. возникло направление, названное негативной  евгеникой , концепция которой состояла в том, что необходимо насильственно ограничить деторождение у лиц с наследственной патологией. К счастью, практическая реализация этой идеи была не- долгой из-за общественного давления.

Существует тяжёлое заболевание  – гиперхолестеринемия. Причиной его является недостаток или дефект генов ЛПНП-рецептора – мелких структур на поверхности клеток печени, "вытягивающих" липопротеиды низкой плотности (ЛПНП), вредные для здоровья человека, из крови и ответственных за их разрушение и ответственных за их разрушение в печени.

Джеймс Вильсон, бывший исследователь  из Медицинской школы Мичиганского университета в Энн-Арбор, сделал попытку внедрить копии нормального гена ЛПНП-рецептора пациенту.

Сначала он отделил у женщины 15% печени (6 млрд. клеток), которые были выращены в 800 чашках с питательными средствами. В них был введён искусственно выведенный безвредный вирус, содержащий нужный ген. Восприняли ген около 20% растущих клеток печени. Модифицированные клетки были введены в тело пациентки  с помощью катетера в вену, ведущую  непосредственно к печени, где, как  рассчитывал исследователь, они  присоединятся к остальным клеткам  и начнут делиться. Через несколько  месяцев малая печёночная биопсия  показала, что новый ген функционирует  в некоторых из введённых клетках печени. Более того, содержание ЛПНП в крови пациентки упало на 15-30%. Вильсон сказал, что улучшение стало достаточным для того, чтобы далее обходиться только лекарствами для дальнейшего снижения уровня ЛПНП.

Решающие достижения молекулярной биологии и генетики в изучении тонкой структуры генов эукариот, их картирования на хромосомах млекопитающих, и, прежде всего человека, бурный рост в области  биотехнологии и генной инженерии  привели к тому, что уже в 1989 году были предприняты первые попытки  лечения моногенных болезней.

Что же такое генная терапия? Подразумевает  ли она лечение с помощью гена как лекарственного препарата или только лечение путём коррекции мутантного гена?

Генную терапию на современном  этапе можно определить как лечение  наследственных, мультифакториальных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний путём введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций.

Первоначально полагали, что генная терапия позволит исправить дефекты  в гене, которые вызывают моногенные заболевания. Теоретически считали, что коррекция генного дефекта возможна как на уровне соматических, так и зародышевых (половых) клеток. Но многочисленные опыты и эксперименты внесли поправки в эти представления.

Значительно проще исправить не сам дефект в гене, то есть заменить весь мутантный ген или его  повреждённый фрагмент на нормальный, а вводить в организм пациента полноценно работающий ген.

Работы по генной терапии у человека ограничены в основном соматическими  тканями, поскольку манипуляции  на половых или зародышевых клетках  могут привести к серьёзным и  непредсказуемым последствиям.

Уже разработанная и применяемая  на практике методика генной терапии  эффективна не только при лечении  моногенных заболеваний, но и таких широко распространённых патологий мультифакториальной природы (то есть вызванными генетическими и экзогенными факторами), как злокачественные опухоли, многие виды тяжёлых вирусных, сердечно-сосудистых и др. заболеваний.

Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии).

Трансфекция может проводиться с использованием чистой ("голой"-naked) ДНК, легированной (встроенной) в соответствующую плазмиду, или комплексированной ДНК. Комплексированная – плазмидная ДНК, соединённая с солями, белками (трансферрин), органическими полимерами, или ДНК в составе вирусных частиц, предварительно лишённые способности к репликации.

Обнажённая ДНК при внутримышечном введении способна экспрессироваться в количествах, достаточных для развития иммунного ответа на появление новых белков. Этот эффект потенциально может быть использован в целях вакцинации против определённых патогенных вирусов, однако не достаточен для большинства терапевтических целей.

Для доставки генетического материала  идеальной представляется "молекулярная машина", обладающая такими качествами как:

1. высокая степень безопасности и надёжности в сочетании с достаточной дешевизной и возможностью широкого применения;
2. способность сохранять активность при движении в русле крови в течение длительного и контролируемого времени, и при этом не распознаваться иммунной системой, не вызывать воспалительных процессов;
3. высокая избирательность взаимодействия только с клетками-мишенями;
4. достаточный объём генетической информации и высокая эффективность, при которой достигается экспрессия каждой доставляемой молекулы ДНК;
5. возможность трансформировать заданное количество клеток от нескольких процентов до заведомо гарантированной 100%-й трансформации, что особенно важно при лечении онкологических заболеваний и некоторых вирусных инфекций;
6. возможность контролировать как интенсивность, так и время экспрессии на основе данных клинического наблюдения.

ФИЗИЧЕСКИЕ: микроинъекция, инъекция струёй, электропорация, замораживание-оттаивание, биобаллистика (бомбардирование клеток каплями жидкости или суспензией частичек золота с адсорбированной плазмидой).

 

ХИМИЧЕСКИЕ: соли некоторых катионов, например, кальция, ДЕАЕ декстран, полилизин, липосомы.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ: вирусные векторы.

Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro практически решена, а её доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается, то другие характеристики существующих векторных систем-стабильность интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность-всё ещё нуждаются в серьёзных доработках.

Повысить эффективность стабильной интеграции можно :

• путём совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных систем;
• путём создания достаточно стабильных эписомных векторов (то есть ДНК-структур, способных к длительной персистенции внутри ядер).

В последнее время особое внимание уделяется созданию векторов на базе искусственных хромосом млекопитающих. Благодаря наличию основных структурных  элементов такие мини-хромосомы  длительно удерживаются в клетках  и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходимы для  правильной работы гена, в нужной ткани  и в должное время.

Пока в области генной терапии  многое неясно, трудно предусмотреть  все последствия переноса генетического  материала в человеческий организм, а также оценить его терапевтическую  эффективность. Поэтому существует международный запрет на проведение испытаний на половых клетках  и клетках ранних доимплантационных зародышей человека, чтобы предотвратить передачу неблагоприятных генетических изменений потомкам, не допустить засорения генофонда нежелательными искусственными генными конструкциями или внесения мутаций с непредсказуемыми последствиями для будущего человечества.

Ф. Андерсон и Дж. Флетчер сформулировали три условия, которые сегодня общепризнанны. Для разрешения клинических испытаний в области генной терапии необходимо доказать в экспериментах на животных, что:

1. Нужный ген может быть перенесён в соответствующие клетки-мишени, где он будет функционально активен достаточно продолжительное время.
2. Будучи перенесённым в новую для себя среду, этот ген не потеряет свою экспрессию, то есть сохранит эффективность.
3. Такой перенос не вызовет неблагоприятных последствий в организме.
4. Вместе с тем в научной литературе всё чаще и настойчивее раздаются призывы к возобновлению дискуссии о целесообразности генокоррекции зародышевых и половых клеток человека.

 

В настоящее время благодаря  успехам генетики в целом и  существенномау прогрессу теоретической и клинической медицины можно твердо утверждать, что многие наследственные болезни успешно лечатся. Именно такая установка должна быть у врача.

 Общие подходы к лечению  наследственных болезней сходны  с подходами к лечению болезней  любой другой этиологии. При  лечении наследственных болезней  полностью сохраняется принцип  об индивидуализированном лечении  - ведь врач и при наследственной  патологии лечит не просто  болезнь, а болезнь у конкретного  человека. Возможно даже, что и  при наследственной патологии  принцип индивидуализированного  лечения должен соблюдаться еще  строже, потому что гетерогенность наследственных болезней далеко не расшифрована, а, следовательно, с одной и той же клинической картиной могут протекать разные наследственные болезни с различным патогенезом. В зависимости от условий пре- и постанального онтогенеза, а также от всего генотипа индивида фенотипические проявления мутаций у конкретного индивида могут модифицироваться в ту или другую сторону. Следовательно, необходима разная коррекция наследственной болезни у разных лиц.

 Как и при лечении других  хорошо изученных болезней (например, инфекционных), можно выделить три  подхода к лечению наследственных  болезней и болезней с наследственной  предрасположенностью:  симптоматическое ,  патогенетическое ,  этиологическое . Применительно к наследственным болезням в отдельную группу можно выделить хирургические методы, поскольку они иногда выполняют функции симптоматической терапии, иногда патогенетической, иногда и той и другой вместе.

 При симптоматическом и патогенетическом  подходах используются все методы  современного лечения (лекарственное,  генетическое, рентгенорадиологическое,  физиотерапев-тическое, климатическое и т. д.). Генетический диагноз, клинические данные о состоянии больного и вся динамика болезни определяют поведение врача на протяжении всего периода лечения со строгим постоянным соблюдением гипполкратовского принципа "не навреди". При лечении наследственных болезней надо быть особенно внимательным в соблюдении этических и деонтологических принципов в отношении пациента и членов его семьи. Ведь часто речь идет о тяжелых хронических больных с детского возраста.

 Наследственные болезни настолько  разнообразны по типам мутаций,  по звеньям нарушенного обмена, степени вовлеченности в патологический  процесс органов и систем, по  характеру течения, что невозможно  подробно описать лечение всех  наследственных болезней. Изложим  общие принципы лечения наследственной  патологии и разработки новых методов.

 В целом можно ожидать  дальнейших сдвигов в патогенетическом  лечении путем возмещения продуктов  (белков, гормонов) в связи с успехами  физико-химической биологии, генной  инженерии и биотехнологии: уже  получают специфические белки  и гормоны человека, необходимые  для восполнения нарушенного  звена обмена при лечении наследственных  болезней (инсулин, соматотропин, интерферон).

 

 Развитие организма и поддержание   гомеостаза зависят от согласованных  взаимодействий множества генных  продуктов, работающих в метаболических  системах. Эти системы способны  к адаптации, что обеспечивает  гомеостаз в определенном диапазоне  условий окружающей среды.

 Например,  концентрацию глюкозы  в крови регулируют продукты 30-40 генов; их взаимодействие обеспечивает  относительно постоянный уровень  глюкозы, несмотря на нерегулярное  и крайне неравномерное потребление  продуктов, являющихся ее источниками. 

 Полагают, что для нормального  развития и работы  ЦНС необходимо  взаимодействие примерно 10000 генных продуктов.

 Мутации, снижающие адаптивную  способность подобных систем, вызывают  патологические изменения, которые  и называются наследственными  болезнями. Иногда мутация так  повреждает ту или иную систему,  регулирующую развитие или гомеостаз,  что она при любых обстоятельствах  работает плохо либо не работает  совсем, вызывая  моногенную болезнь . В других случаях влияние мутантного гена в обычных условиях невелико, но некоторые факторы окружающей среды усугубляют его действие, вызывая пороки развития или нарушение гомеостаза ; это -  полигенная болезнь .

 Таким образом, и в норме,  и при патологии гены играют  важную и неоднозначную роль. Поэтому и лечение наследственных  болезней сложно и часто не вполне эффективно.

 Для лечения наследственных  болезней необходимо:

- поставить точный диагноз; 

- начать лечение до развития  необратимых повреждений тканей;

- иметь четкое представление  о патогенезе заболевания и  о вызывающих его биохимических  нарушениях.