Использование ДНК для получения наноструктур

 

 

 

Наноконструкцию на основе двухцепочечных ДНК получали по следующей схеме: из двухцепочечных молекул ДНК формировали жидкокристаллический дисплей (кривая 1, рис.2), добавляли к ней раствор антрациклинового антибиотика дауномицина |ДАУ|, до формирования «внешнего» комплекса (кривая 2), и затем обрабатывали раствором CuCl2 (кривая 3). При добавлении CuCl2 к жидкокристаллическому дисплею ДНК, обработанной раствором антрациклинового антибиотика и имеющей равновесное значение амплитуды полосы при λ ~ 500 нм (кривая 2), происходит усиление (амплификация) полосы, соответствующей оптическим свойствам хромофора комплекса |ДАУ – Cu2+|. При использовании нами условиях (молярная масса ДНК ~ 8*105 Да, концентрация ДНК ~ 5 мкг/мл) максимальная амплитуда полосы при λ ~ 500 нм составляет приблизительно 2500 единиц.

Амплификация полосы при λ ~ 500 нм свидетельствует о том, что хромофор комплекса |ДАУ – Cu2+| пространственно фиксирован относительно молекул ДНК в составе частиц жидкокристаллических дисплеев [13]. Хотя существует две разные модели фиксации комплексов |ДАУ – Cu2+| вблизи поверхности молекул ДНК [14,15], экспериментальные данные позволяют сделать однозначный выбор в пользу модели комплекса, выполняющего функцию «наномостика» между молекулами ДНК [16]. Эффективность образования наномостиков зависит от концентрации как молекул ДАУ, так и ионов меди [13].

«Критическая» концентрация в случае ДАУ означает, что в образовании наномостиков принимают участие те молекулы ДАУ, которые становятся доступными для химической реакции после завершения интеркаляции ДАУ. Критическая концентрация в случае ионов меди показывает, что эти ионы индуцируют в молекуле нуклеиновой кислоты какие-то изменения, после чего ионы меди (или их комплексы с парами оснований и (или) ДАУ) становятся доступными для дальнейшего хелатообразования, необходимого для строительства наномостиков. (Это означает, что порядок добавления компонентов, а именно, ДАУ и ионов меди, важен для построения наномостиков).

Экспериментальные данные, полученные при помощи разных физических методов, включая низкотемпературную магнитометрию, показывают, что в состав наномостика может входить до 6 ионов меди (II), и наномостик […— Cu2+ — ДАУ— Cu2+ -...] имеет структуру, показанную на рис. 3. Наномостики представляют собой плоские хелатные комплексы, которые возникают между пространственно упорядоченными молекулами ДНК, расположенными как в одном слое, так и в соседних слоях [16]. Этот процесс приводит к возникновению трехмерной наноконструкции.

 

 

 

Можно перечислить некоторые свойства созданной наноконструкции. Во-первых, в отличие от исходных частиц жидкокристаллических дисплеев, свойства наноконструкции не зависят от осмотического давления раствора, а определяются числом наномостиков. Во-вторых, холестерическая структура исходных частиц жидкокристаллических дисплеев двухцепочечных ДНК теряет свой «жидкостной» характер. В-третьих, для наноконструкции ДНК характерна не только аномальная оптическая активность, проявляемая в виде интенсивной полосы в спектре КД в области поглощения ДНК, но и дополни- тельная аномальная оптическая активность в области поглощения хромофоров антибиотика. В-четвертых, наноконструкция характеризуется двумя тепловыми структурными переходами: один из них соответствует «КД-плавлению» наномостиков, другой — «КД-плавлению» холестерика ДНК. Величина «температуры плавления», τпл, наномостиков растет по мере увеличения концентрации их структурных элементов, оставаясь при этом ниже величины τпл исходного холестерика двухцепочечного ДНК [17] . Наконец, в наноконструкции сохраняется высокая локальная концентрация молекул ДНК (достигающая 400 мг/мл!), а следовательно, в составе наноконструкции возникает высокая концентрация противоопухолевого антибиотика — дауномицина.

Сказанное выше означает, что наноконструкция представляет собой новый тип биоматериала, свойства которого можно регулировать в широких пределах.

Учитывая стабильность наноконструкции, ее частицы были визуализированы при помощи атомного силового микроскопа [16]. Частицы по форме близки к вытянутым цилиндрам. Оценка размера 400 частиц показывает, что хотя размер частиц меняется в пределах от 0.4 до 0.8 мкм, средняя величина составляет около 0.5 мкм. Это означает, что размер полученных нами частиц жидкокристаллических дисплеев, в составе которых молекулы ДНК «сшиты» наномостиками (т.е. наноконструкций, существующих в отсутствии осмотического давления раствора), совпадает с размером исходных частиц ЖКД из двухцепочечных молекул ДНК, рассчитываемым теоретически в случае растворов с постоянным осмотическим давлением [18].

Таким образом, технология, основанная на «энтропийной конденсации» исходных двухцепочечных нуклеиновых кислот, приводит к созданию наноконструкций, обладающих уникальными свойствами.

 

4 ПРОСТРАНСТВЕННОЕ УПОРЯДОЧЕНИЕ КОМПЛЕКСОВ ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫХ МОЛЕКУЛ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ПОЛИКАТИОНАМИ В РЕЗУЛЬТАТЕ «ЭНТАЛЬПИЙНОЙ КОНДЕНСАЦИИ» И НАНОКОНСТРУКЦИИ  НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛ ЭТИХ ПОЛИКАТИОНОВ.

Альтернативу рассмотренному выше подходу к наноконструированию может составить второй вариант технологии, основанный на так называемой «энтальпийной конденсации» двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот. Для реализации этого варианта пространственного упорядочения молекул ДНК используют природные или синтетические катионы, которые, образуя комплексы с нуклеиновыми кислотами  в водно-солевых растворах, обеспечивают нейтрализацию 80—90% отрицательных зарядов фосфатных групп молекул нуклеиновых кислот, вызывая спонтанное фазовое исключение этих молекул из растворов. При таком фазовом исключении могут формироваться жидкокристаллические дисплеи. В качестве поликатионов, вызывающих образование ЖКД, использованы полиамины, полиаминокислоты, белки (гистоны) и т.д. Однако в этом случае свойства частиц жидкокристаллических дисплеев заметно отличаются от свойств частиц ЖКД, образующихся при «энтропийной конденсации» нуклеиновых кислот. Во-первых, вводимый в систему поликатион, входит в состав частиц жидкокристаллических дисплеев, образующихся в водно-солевых растворах.  Во-вторых, в зависимости от эмпирического сочетания нескольких факторов, а именно, ионной силы раствора, содержания положительно заряженных групп, стерической структуры молекулы поликатиона и т.д., реализуются разные способы упаковки молекул комплексов (НК-поликатион) в образующихся частицах. Как правило, это гексагональная упаковка комплексов (НК-поликатион) в частицах ЖКД, для которой характерны брэгговские расстояния в пределах от 26 до 29 Ǻ [19]. Однако в некоторых случаях при удачном выборе поликатиона удается реализовать холестерическую упаковку комплексов (НК-поликатион) [19].

С этой точки зрения внимание привлекают полиаминосахара, в частности природный биодеградируемый полимер — хитозан (поли[β(1—>4)-2-амино-2-деокси- D-глюкопираноза]). Показано, что взаимодействие этого поликатиона с двухцепочечным ДНК приводит к образованию холестерических жидкокристаллических дисплеев [20], имеющих аномальные полосы в спектре. На кривых рассеяния рентгеновских лучей на фазе, сформированной из частиц ЖКД дисперсии комплекса (ДНК-Хи), присутствует один брэгговский рефлекс (d Брэгг ~ 26 A °). Величина брэгговского рефлекса, характеризующая среднее расстояние между соседними молекулами комплексов (ДНК-Хи) в образованной фазе, существенно меньше по сравнению с величиной d Брэгг, характерной для частиц ЖКД «чистой» ДНК, и соответствует переходной области между холестерической и гексагональной жидкокристаллической фазами [19].

 Ряд свойств молекул хитозана (Хи) в составе комплексов (ДНК-Хи) интересен с точки зрения наноконструирования. Во-первых, в силу стерической структуры молекул Хи только часть аминогрупп этих молекул взаимодействует с фосфатными группами ДНК, другая часть аминогрупп оказывается экспонированной во «внешнюю» среду. Во-вторых, амино- и гидроксильные группы соседних сахарных остатков молекул Хи могут образовывать прочные комплексы с ионами металлов [21]. В частности, константа связывания иона двухвалентной меди составляет около 1014 М [21,22], причем образующийся хелатный комплекс имеет планарную структуру. Такой комплекс, в принципе, может служить местом «начала» («окончания») наномостиков, которые в этом случае соединят не молекулы ДНК, а молекулы Хи, фиксированные на поверхности ДНК. Наконец, аномальная полоса в спектре ЖК дисплея комплексов (ДНК-Хи), имеющая в зависимости от целого ряда условий либо положительный, либо отрицательный знак, позволит следить за изменениями в пространственной структуре частиц ЖК дисплеев.

Имея на руках данные, характеризующие свойства наноконструкций на основе двухцепочечных  молекул ДНК, и учитывая свойства частиц ЖК дисплея комплексов (ДНК-Хи), была предпринята попытка создания наномостиков между соседними молекулами Хи, фиксированными в структуре частиц их ЖК дисплеев.

При добавлении CuCl2 к ЖК дисплею комплекса (ДНК- Хи), имеющей положительный знак полосы в спектре и последующей ее обработке ДАУ, возникает интенсивная положительная полоса при λ~ 500 нм (рис. 4), соответствующая оптическим свойствам хромофора комплекса [ДАУ— Cu2+].

 

 

 

 

 

 

 

Аналогичная амплификация наблюдается также при обработке ЖК дисплея, сформированной из комплекса (ДНК-Хи), в котором молекулы Хи имеют другое содержание аминогрупп, и ЖК дисплей этого комплекса (ДНК-Хи) характеризуется отрицательной полосой в спектре.

Амплификация полосы в области поглощения хромофора [ДАУ— Cu2+] показывает, что этот хромофор пространственно фиксирован по отношению к молекулам Хи в любых ЖК дисплеях, сформированных из комплексов (ДНК-Хи).

Эффективность нарастания аномальной полосы в спектре  ЖК дисплея комплексов (ДНК-Хи) зависит также, как и в случае «чистой» ДНК, от концентрации молекул ДАУ и ионов меди.

 Не исключено, что, также  как и в случае чистой ДНК, часть молекул ДАУ может интеркалировать между парами оснований ДНК в составе комплекса (ДНК-Хи), но этот процесс быстро достигает своего равновесия.

Отсутствие «критической» концентрация в случае ионов меди означает, что в отличие от случая «чистой» ДНК в молекулах Хи, фиксированных в структуре комплекса (ДНК-Хи), всегда имеются химические группы, стерически доступные для реакции хелатообразования. Такими группами могут быть аминогруппы и гидроксильные группы сахарных остатков Хи, образующие хелатные комплексы с ионами меди с высокой константой связывания [21,22].

Сопоставление полученных результатов (рис. 6) с результатами формирования наномостиков в случае «чистой» ДНК (рис. 2) свидетельствует об их качественном соответствии. На основании этого можно утверждать, что амплификация полосы при λ ~ 500 нм в спектрах  ЖК дисплеев разных комплексов (ДНК-Хи) обусловлена возникновением наномостиков типа […— Cu2+ — ДАУ— Cu2+ -...] между соседними молекулами Хи, связанными в комплексы с молекулами ДНК в составе частиц ЖК дисплея.

Учитывая тот факт, что в этом случае, так же как и в случае «чистой» ДНК, наномостики могут возникать между соседними молекулами Хи, расположенными как в одном слое, так и молекулами Хи в соседних слоях, амплификация полосы λ ~ 500 нм отражает возникновение пространственной наноконструкции. Это означает, что формирование наноконструкций на основе ЖК дисплеев молекул ДНК комплексов (ДНК - Хи) имеет во всех случаях одно и тоже оптическое «проявление».

Интересным результатом, указывающим на то, что конформация молекул Хи важна для наноконструирования, является зависимость величины аномальной амплитуды полосы (λ 505 нм) в спектрах КД ЖКД комплексов (ДНК-Хи) от содержания аминогрупп в молекулах Хи. Данные, приведенные в работе [23], показывают, что имеется минимальное (предельно малое) расстояние между аминогруппами (около 12 Ǻ, что приблизительно соответствует расстоянию между этими группами «через одну»), на котором могут находиться соседние наномостики […— Cu2+ — ДАУ— Cu2+-... ]. Малая величина аномальной оптической активности в этих условиях может быть обусловлена двумя причинами. Во-первых, не исключено, что, несмотря на высокую концентрацию потенциальных мест образования наномостиков, т.е. высокую концентрацию амино- и гидроксильных групп в молекулах Хи, стерическая структура молекул Хи не является оптимальной для образования наномостиков. Во-вторых, не исключено, что при малом расстоянии между потенциальными местами образования наномостиков […— Cu2+ — ДАУ— Cu2+ -..] стерическое взаимодействие между компонентами наномостиков, в частности между объемными аминосахарными остатками молекул ДАУ, запрещает их близкое расположение. По мере увеличения расстояния между аминогруппами в молекулах Хи стерическая структура молекулы Хи меняется таким образом, что ориентация соседних амино- и гидроксильных групп в сахарных остатках Хи оказывается достаточной для оптимальной ориентации соседних наномостиков в создаваемой наноконструкции, и в этих условиях обеспечивается высокая аномальная оптическая активность наноконструкции.

С этой точки зрения интересно сопоставить значения максимальных амплитуд полос, наблюдаемых при создании наноконструкции на основе ЖК дисплеев чистой ДНК и комплексов (ДНК-Хи). При использованных нами условиях (мол. масса ДНК ~ 8х105 Да, концентрация ДНК ~ 15 мкг/мл) максимальная амплитуда полосы при λ ~ 500 нм, характерная для ЖКД комплексов (ДНК-Хи), не превышает 2500 единиц ∆А, несмотря на разные препараты Хи. Если сопоставить это значение со значением амплитуды, измеренным ранее для ЖК дисплея ДНК и учесть корреляцию между концентрацией ДНК и амплитудой аномальной полосы в спектре для ЖКД, то можно утверждать, что в случае ЖКД комплексов (ДНК- Хи) амплитуда максимальной полосы приблизительно в 3 раза меньше по сравнению с амплитудой полосы, характерной для наноконструкций, сформированных из ЖК дисплея  «чистых» двухцепочечных ДНК. Такое различие может быть следствием нескольких причин. Во-первых, оно может отражать меньшее число наномостиков, во-вторых, оно может отражать меньшую физическую длину (размер) наномостиков, поскольку расстояние между молекулами комплекса (ДНК-Хи) меньше по сравнению с расстоянием между «чистыми» молекулами ДНК, и, наконец, оно может быть связано с тем, что угол наклона наномостиков между молекулами Хи в составе комплекса (ДНК-Хи) в ЖК дисплеях отличается от угла наклона в случае наномостиков между «чистыми» молекулами ДНК, что может быть связано с конформацией молекул Хи, расположенных на соседних молекулах ДНК.

Тот факт, что в случае ЖКД комплексов (ДНК-Хи) физический размер наномостиков может быть небольшим, в сочетании с тем, что ионы меди могут образовывать очень прочные хелатные комплексы с соседними амино- и гидроксильной группами сахарных остатков Хи  [24,25], позволяет предполагать, что структура и свойства полученных наноконструкций могут заметно отличаться от свойств наноконструкций на основе «чистой» ДНК. Действительно, как показывают предварительные опыты, амплитуда аномальной полосы (λ 505 нм) в спектрах ЖК дисплеев наноконструкций на основе разных комплексов (ДНК-Хи) практически не меняется при увеличении температуры. Это означает, что пространственная структура ЖКД комплексов (ДНК-Хи) остается неизменной при использованных условиях нагревания, т.е. тепловая стабильность наноконструкций на основе ЖКД комплексов (ДНК-

Хи) заметно превышает стабильность не только наноконструкций на основе «чистой» ДНК, но и ЖК дисплеев, сформированной из комплексов (ДНК-Хи).

Очевидно, что для построения конкретной модели наномостиков между соседними молекулами комплексов (ДНК-Хи) в частицах ЖК дисплея, а следовательно, для построения пространственной модели наноконструкции требуется проведение дополнительных исследований.