Контрольная работа по "Микробиологии"

1) Реакции  лизиса - Сущность этих реакций состоит в том, что при взаимодействии специфических антител с антигенами клеток (эритроцитов, бактерий), на их поверхности образуется комплекс, который активирует комплемент по классическому пути, вследствие чего наступает лизис этих клеток.

Примером реакции лизиса является индикаторная система в  РСК: эритроциты, обработанные антисывороткой, к которым добавлен комплемент. Многие бактерии устойчивы к литическому  действию комплемента, поэтому реакция  бакгериолизиса применяется редко. Однако реакция лизиса используется при типировании (выявлении) антигенов системы HLA на лимфоцитах. К типируемым лимфоцитам добавляют антисыворотки против различных HLA-антигенов, затем их отмывают и добавляют комплемент. Если соответствующий антиген есть, то наступает лизис лимфоцитов. Мертвые клетки в отличие от живых окрашиваются трипановым синим.

2) Реакция связывания  комплемента (РСК) - В РСК помимо антигена и антител принимает участие третий компонент - комплемент, который способен связываться с комплексом антиген-антитело. РСК позволяет выявлять антигены при наличии к ним антисывороток или антитела с помощью антигенов-диагностикумов.

Образование комплексов антиген-антитело и фиксация комплемента не сопровождаются видимыми изменениями. Для обнаружения связывания комплемента используют дополнительную индикаторную гемолитическую систему. Эта система состоит из эритроцитов барана, обработанных гемолитической антисывороткой. В присутствии комплемента (сыворотки морской свинки) происходит лизис эритроцитов.

Принцип метода состоит в  том, что если в опытной системе  образовался комплекс антиген-антитело, который связал комплемент, то не будет  лизиса эритроцитов в индикаторной гемолитической системе (РСК положительная, выявлен антиген или антитело). Если в опытной системе комплекс антиген-антитело не формируется, комплемент остается свободным, взаимодействует с гемолитической системой и вызывает лизис эритроцитов (РСК отрицательная, есть гемолиз). РСК лежит в основе реакции Вассермана, которая применяется для диагностики сифилиса.

3) Реакции нейтрализации  экзотоксинов и вирусов - Реакция нейтрализации экзотоксина происходит при его взаимодействии с антитоксической сывороткой (антитела-антитоксины). В результате образовании комплекса антиген-антитело токсин теряет свои ядовитые свойства.

Реакцию нейтрализации проводят с целью обнаружения и титрования токсинов, анатоксинов или антитоксинов.

Токсины получают путем фильтрования жидкой питательной среды или  исследуемого материала, где размножались токсигенные бактерии. При обработке формалином в течение 30-45 дней при температуре 37°С токсин превращается в анатоксин, который используют для иммунизации животных с целью получения антитоксической сыворотки.

Варианты постановки реакции  нейтрализации токсина: Реакция флоккуляции основана на способности токсина или анатоксина при смешивании в эквивалентных соотношениях с антитоксической сывороткой образовывать помутнение в пробирке. Механизм флоккуляции аналогичен механизму реакции преципитации. Используют для количественного определения токсинов или анатоксинов.

Реакция нейтрализации in vivo. Для определения типа токсина  его смешивают с диагностической  антитоксической сывороткой и эту  смесь вводят белым мышам. При  нейтрализации токсина антитоксической  сывороткой мыши не погибают.

Реакцию нейтрализации используют для определения антитоксического иммунитета у детей при дифтерии (проба Шика) и скарлатине (проба  Дика). Для этого в область предплечья внутрикожно вводят определенное количество соответствующего токсина (1/40 DLM). При наличии в организме антитоксинов произойдет нейтрализация токсина и реакция будет отрицательной. При отсутствии антитоксинов  организме возникает воспалительная реакция на месте введения токсина.

Реакция нейтрализации вирусов. Данная реакция используется для идентификации вирусов. Для этого к исследуемому материалу, содержащему неизвестный вирус, добавляют специфическую противовирусную сыворотку. После инкубации эту смесь вводят либо в куриный эмбрион, либо лабораторному животному, либо в культуру клеток. Наиболее распространена реакция нейтрализации вирусов в культуре клеток. Здесь в культуральную среду добавляется индикатор. Если антитела соответствуют вирусу (нейтрализуют его), то клеточная культура развивается нормально. При этом происходит выделение кислых продуктов клеточного метаболизма, рН среды снижается, и индикатор изменяет свой цвет. В контроле вирус быстро разрушает клеточную культуру, рН не меняется, и цвет среды остается прежним.

На этом же принципе основана реакция ингибиции метаболизма для идентификации миксплазм.

4) Реакция иммобилизации — серологическая реакция, основанная на феномене обездвиживания подвижных форм бактерий с помощью антител, содержащихся в сыворотке иммунных лиц или в иммунной диагностической сыворотке. Применяется в диагностических целях при сифилисе, холере и других инфекциях.

5) Иммуноферментный  анализ. ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодифузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс.

 

Рисунок 1. Основной принцып  ИФА.

1) Для выявления антигенов. 2) Для выявления антител.

Метод основан на специфическом  связывании антитела с антигеном, при  этом один из компонентов конъюгирован с ферментом, в результатереакции с соответствующим хромогенным субстратом образовывается окрашенный продукт, количество которого можно определить спектрофотометрически (рис. 1).

Открытие возможности  иммобилизации антигена и антитела на различных носителях с сохранением  их связывающей активности позволило расширить использование ИФА в различных областях биологии и медицины.

Появление моноклональных антител  послужило дальнейшему развитию ИФА, что позволило повысить его  чувствительность, специфичность и  воспроизводимость результатов.

Теоретически ИФА основывается на данных современной иммунохимии и химической энзимологии, знании физико-химических закономерностей реакции антиген-антитело, а также на главных принципах аналитической химии. Чувствительность ИФА и время его проведения определяется несколькими основными факторами: кинетическими, термодинамическими характеристиками реакции антиген-антитело, соотношением реагентов, активностью фермента и разрешающей способностью методов его детекции. В общем виде реакция антиген-антитело может быть описана простой схемой:

[AT]+[АГ]↔[АТАГ]

Разнообразие  объектов исследования от низкомолекулярных  соединений до вирусов и бактерий, а также необычайно широкий круг задач, связанных с многообразием  условий применения ИФА, обусловливают  разработку чрезвычайно большого количество вариантов этого метода.

Любой вариант  ИФА содержит 3 обязательные стадии:

1. стадия узнавания  тестируемого соединения специфическим  к нему антителом, что ведет  к образованию иммунного комплекса; 

2. стадия формирования  связи конъюгата с иммунным комплексом или со свободными местами связывания;

3. стадия превращения  ферментной метки в регистрируемый  сигнал.

Метод радиоиммунного анализа.

Реакции с использованием меченых AT и Аг составляют основу методов  экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное содержание Аг и AT в исследуемых образцах. В качестве меток могут быть использованы различные ферменты, красители-флюорохромы и изотопы.

В основе метода радиоиммунного анализа (РИА) — маркирование радионуклидом Аг или AT, вступающих в реакцию. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счётчиках импульсов. Наибольшее распространение получил радиоиммунный анализ на твёрдой фазе (твердофазный РИА) с использованием меченых Аг или AT, сорбированных в лунках полистироловых панелей. РИА применяют для выявления микробных Аг, различных гормонов, ферментов и т.д. Широкое распространение метода ограничивает необходимость создания условий, обеспечивающих безопасность работы с радионуклидами.

6) Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — это метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. Метод основан на микроскопии окрашенных специальным образом мазков и других образцов тканей. Применяется в основном для обнаружения возбудителей инфекций мочеполовых путей, таких как хламидии, микоплазмы, трихомонады, гонококки, вирус герпеса и пр.

 Существует два типа  реакции иммунофлюоресценции —  прямая и непрямая.

- Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) — в этом случае непосредственно специфическое антитело мечено флюорохромом и реакция проходит в один этап, что значительно сокращает сроки исследования.

- Непрямая иммунофлюоресценция (РНИФ) — в этом случае специфическое антитело не имеет метки, а для выявления комплекса антиген-антитело, образовавшегося на первом этапе, используют вторые меченые антитела, специфичные к конкретным антителам.

 Материалом для исследования  служат мазки. Техника взятия  мазков не представляет опасности  для здоровья и является безболезненной. Реакцию оценивают с помощью люминисцентного микроскопа. Если тестируемые возбудители присутствуют, то они светятся, как светлячки в объективе микроскопа.

Этот метод не зависит  от возможного изменения тинкториальных (способности окрашиваться) свойств  микроорганизма в процессе заболевания и лечения. ПИФ-метод является важнейшим скрининговым методом диагностики урогенитального хламидиоза (в медицине под скринингом понимают проведение простых и безопасных исследований большим группам населения с целью выделения групп риска развития той или иной инфекции).

 РИФ при правильной  подготовке пациента, соблюдении  правил взятия материала и  постановки реакции является  высокочувствительным и специфичным  методом диагностики урогенитального  хламидиоза и позволяет выявлять  возбудителя у 80–90% больных. Данный метод относительно дешев, прост в выполнении, не требует специального дорогостоящего оборудования, позволяет быстро получить результат (до 30–50 минут) и визуально котролировать качество взятия материала для исследования.

 В целом, методика РИФ отвечает критериям высокой чувствительности и специфичности, но требует исполнения опытным, компетентным лабораторным работником.

7) Полимера́зная цепна́я реа́кция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество  других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Проведение ПЦР

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20—40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований.

Чтобы избежать испарения  реакционной смеси, в пробирку добавляют  высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся  крышкой, этого делать не требуется.