Культуры клеток и тканей, методы культивирования вирусов, вирусологические методы исследования

Западно- Казахстанский государственный медицинский университет им. М. Оспанова

 

Кафедра

Дисциплина: Микробиология

 

 

 

 

Самостоятельная работа студента

на тему

«Культуры клеток и тканей, методы культивирования вирусов,

вирусологические методы исследования»

 

 

 

Подготовила: Бигалиева Д. К.

студентка 218 А гр.

Приняла: Мукашева Р. Н.

 

 

 

 

 

Актобе, 2014

 План:

Введение

1. Культуры клеток и  тканей.

2. Выращивание вирусов  в культурах клеток или тканей.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ВВЕДЕНИЕ

 
Для количественного накопления вирусов наиболее удобную систему представляют культуры клеток. Первые попытки культивирования клеток животных вне организма относятся к концу прошлого столетия. Эти отрывочные наблюдения указывали на возможность сохранения жизнеспособности тканей и клеток в искусственных условиях и положили начало глубоким научным исследованиям тканевых культур.

Большая заслуга в деле paзработки методов культивирования тканей принадлежит Каррелю Он впервые доказал возможность размножения клеток животных в искусственных условиях и тем самым продемонстрировал их «бессмертность» и сходство с одноклеточными свободноживущими организмами. Значительных успехов в этом направлении достигла группа исследователей под руководством Эрла. Они первые получили рост большого числа клеток на стекле и в жидкой перемешиваемой суспензии. Появление антибиотиков и успехи в создании искусственных питательных сред открыли новую эру в развитии методов тканевых культур.

Тканевые культуры давно нашли применение для решения различных вопросов биологии и медицины. Однако лишь успехи в области вирусологии, достигнутые с помощью тканевых культур, явились мощным стимулом их развития до современного уровня.

Культивирование вирусов помогает решить ряд теоретически проблем, связанных с изучением особенностей взаимодействия "вирус-клетка". Кроме того решение целого ряда прикладных задач, связанных с диагностикой и производством препаратов для профилактики вирусных инфекций невозможно без накопления вируссодержащего сырья.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ, метод сохранения в жизнеспособном состоянии клеток, участков тканей, органов или их частей вне организма. Во 2-й пол. 19 в. развитие микробиологии, прежде всего медицинской (необходимость выделения и изучения микробов, вызывающих инфекционные болезни), а также производств, основанных на процессах брожения (виноделие и др.), привело к созданию методов культивирования клеток бактерий, дрожжей и других микроорганизмов, т. е. методов их выделения, выращивания, размножения и сохранения в искусственных условиях. Были разработаны составы жидких и твёрдых питательных сред, методы, обеспечивающие их стерильность, способы выращивания чистых культур, состоящих из клеток одного вида, и т. д. К сер. 20 в. было освоено культивирование микроорганизмов в промышленных масштабах.  
 
Первые опыты по выращиванию клеток и тканей животных вне организма были сделаны в нач. 20 в. Дальнейшее совершенствование метода шло параллельно успехам цитологии, биохимии, генетики, эмбриологии, молекулярной биологии. Его возможности возросли после того, как научились получать изолированные клетки из различных животных тканей (путём их обработки специальными ферментами, растворяющими межклеточное вещество и разрушающими межклеточные контакты) и выяснили потребности разных клеток в гормонах, факторах роста и др. веществах, вносимых в искусственные питательные среды. Очевидные преимущества работы с генетически однородными клетками и тканями в контролируемых условиях вне организма по сравнению с проведением исследований на целых организмах сделали этот метод одним из наиболее универсальных в биологии. Столь же плодотворным оказалось его применение в медицине и при решении ряда задач сельского хозяйства и биотехнологии.  
 
Клеточные и тканевые культуры использовались для изучения закономерностей митоза и числа клеточных циклов (делений) у клеток разных типов и выяснения в связи с этим «запрограммированности» процесса старения, для изучения механизмов клеточной дифференцировки, формирования специализированных тканей и органов, а также (при совместном культивировании) влияния друг на друга клеток разных типов. Культура клеток и тканей растений появилась позднее – в 1958 г., но уже всего через 6лет из единственной клетки, извлечённой из корня моркови, удалось в условиях культуры вырастить целое растение с дифференцированными тканями и органами. Это направление широко применяется в селекции и биотехнологии.  
 
Совместное культивирование клеток разных линий (клонов) привело к рождению нового важного раздела в экспериментальной биологии – генетики соматических клеток и прежде всего метода гибридизации соматических клеток.  
 
Клеточные и тканевые культуры позволяют исследовать такие важные для медицины проблемы, как перерождение нормальных клеток в опухолевые, всесторонне изучать их свойства, чувствительность клеток к физическим и химическим факторам, в т. ч. клекарствам, а также определять потенциальную мутагенность и канцерогенно-сти этих факторов, т. е. их способность вызыватьмутации и опухоли. Разработка методов длительного культивирования позволяет формировать банки клеточных линий, обладающих определёнными генетическими и биохимическими свойствами. На этой основе создаются методы криоконсервации (от греч. «криос» – холод) – сохранение в условиях глубокого охлаждения клеток, тканей и органов для трансплантации (пересадки), в качестве резервного генофонда редких и исчезающих биологических видов, а также для других целей. С кон. 20 в. стали возникать банки, в которых хранятся замороженные стволовые клетки, используемые для лечения самых различных болезней и травм.  
 

2. Паразитируя на генетическом уровне как молекулы НК, вирусы, лишенные энергообменных систем, не могут, подобно бактериям, размножаться на искусственных питательных средах. Процесс их воспроизводства (репродукции) всецело обусловлен метаболизмом ограниченного круга чувствительных организмов и клеток, которые в вирусологии называют хозяевами. Выращивают вирусы в культурах клеток или тканей, 7—13-дневных куриных эмбрионах и организме лабораторных животных, среди которых чаще всего используются белые мыши, преимущественно 1-4-дневные сосунки, кролики, сирийские хомяки и африканские хорьки. Культура клеток - это выращенные in vitro (вне организма) на специальных средах клетки различных тканей животных и человека, в том числе лейкоциты, сохраняющие присущие им обмен и восприимчивость к определенным вирусам. Главное требование при работе с культурами клеток и вирусами - строгое соблюдение стерильности, которое достигается в асептических условиях вирусологического бокса. Для выращивания клеток (тканей) применяют различные питательные среды (199 или Игла), содержащие полный набор необходимых им веществ (аминокислоты, пурины, пиримидины, углеводы, витамины и др.) с добавлением бычьей сыворотки.

Имеется много типов культур клеток: 1) первичные культуры, способные к 5-10-кратному пассированию; 2) неограниченно перевиваемые; 3) полуперевиваемые, представляющие собой морфологически однородные клетки легких и почек человека, сохраняющие в 50 пассажах диплоидный набор хромосом. Все эти типы клеток выращивают при температуре 36-37 °С в ультратермостатах, получая в течение 5-7 суток хороший монослой в виде пласта, сцепленного со стенками матрацев, флаконов и пробирок. Контролируют рост клеток под малым увеличением микроскопа, начиная с 3-4 дня. I. Культуры переживающих эксплантатов тканей.

II. Культуры растущих тканей: 
1) культуры фиксированных кусочков ткани; 
2) однослойные культуры клеток:

а) первично-трипсинизированные (однократно культивируемые);

б) перевиваемые клеточные культуры;

в) полуперевиваемые культуры клеток (штаммы диплоидных клеток человека и животных)

III. Суспензионные культуры  растущих клеток.

Культуры клеток готовят из тканей животных или человека. Культуры подразделяют на первичные (неперевиваемые), полуперевиваемые и перевиваемые.

Приготовление первичной культуры клеток складывается из нескольких последовательных этапов: измельчения ткани, разъединения клеток путем трипсинизации, отмывания полученной однородной суспензии изолированных клеток от трипсина с последующим суспендированием клеток в питательной среде, обеспечивающей их рост, например в среде 199 с добавлением телячьей сыворотки крови.

Перевиваемые культуры в отличие от первичных адаптированы к условиям, обеспечивающим им постоянное существование in vitro, и сохраняются на протяжении нескольких десятков пассажей.

Перевиваемые однослойные культуры клеток приготовляют из злокачественных и нормальных линий клеток, обладающих способностью длительно размножаться in vitro в определенных условиях. К ним относятся злокачественные клетки HeLa, первоначально выделенные из карциномы шейки матки, Нер-3 (из лимфоидной карциномы), а также нормальные клетки амниона человека, почек обезьяны и др.

К полуперевиваемым культурам относятся диплоидные клетки человека. Они представляют собой клеточную систему, сохраняющую в процессе 50 пассажей (до года) диплоидный набор хромосом, типичный для соматических клеток используемой ткани. Диплоидные клетки человека не претерпевают злокачественного перерождения и этим выгодно отличаются от опухолевых.

 

 

      

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. Культивирование вирусов человека и животных проводят с целью лабораторной диагностики

вирусных инфекций, для изучения вопросов патогенеза и иммунитета, получения

диагностических и вакцинных препаратов, применяют в научно-исследовательской работе.

Поскольку вирусы являются абсолютными паразитами, их культивируют или на уровне

организма, или на уровне живых клеток, выращиваемых вне организма в искусственных

условиях.

 В качестве биологических  моделей для культивирования  используют лабораторных

животных, развивающиеся куриные эмбрионы и культуры клеток.

 

Лабораторные животные                                             

(белые мыши, хлопковые крысы, і  кролики, хомяки, обезьяны и др.) в

начальный период развития вирусологии были единственной экспериментальной биологической

моделью, которую использовали для размножения и 1 изучения свойств вирусов. На основании

развития типичных признаков заболевания и патоморфологических изменений органов I

животных можно судить о репродукции вирусов, т. е. проводить 1 индикацию вирусов. В

настоящее время применение этой модели для диагностики ограничено из-за

невосприимчивости животных ко многим вирусам человека.

 

                    Экспериментальные модели для  некоторых вирусов

Наименование вируса	Экспериментальная  модель
Вирус бешенства Вирус Коксаки Вирус полиомиелита Вирус гриппа Вирус клещевого энцефалита	Мыши, кролики Мыши-сосунки Обезьяны, крысы Мыши, хорьки Мыши

 

 

 

 

Куриные эмбрионы предложены в качестве экспериментальной модели для культивирования

вирусов в середине 30-х годов I ф. Бернетом. К достоинствам модели относятся возможность

накопления вирусов в больших количествах, стерильность объекта, отсутствие скрытых

вирусных инфекций, простота техники работы. Для культивирования вирусов исследуемый

материал вводят в различные полости и ткани куриного зародыша.

Индикацию вирусов осуществляют по характеру специфических поражений оболочек и тела

эмбриона, а также феномену гемагглютинации . склеиванию эритроцитов. Явление гемагглю-

тинации впервые было обнаружено в 1941 г. при культивировании в куриных эмбрионах

вирусов гриппа. Позднее было установлено, что гемагглютинирующими свойствами обладают

многие вирусы. На основе этого феномена была разработана техника реакции гемагглютинации

(РГА) вне организма (in vitro), I которая широко применяется для лабораторной

диагностики вирусных инфекций. Схема постановки реакции гемагглютинации при диагностике гриппа

Ингре- диенты РГА (в мл)	Номера лунок разведения вируссодержащего  материала
	1		2		3		4		5		6		7		8		9
	1:10		1:20		1:40		1:80		1:160		1:320		1:640		1:1280		К
Вирус- содержащий материал	0,1		0,5												0,5 вылить
Физиоло- гический раствор	0,9		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5
1% взвесь эритроцитов		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5		0,5
Возможный результат		+++		+++		+++		+++		+++		++  титр		+		-		-

 

 

 

       С помощью цветной  реакции можно определить соответствие  вируса и вируснейтрализующей  сыворотки, если их предварительно  смешать и эту смесь после  инкубации внести в культуру  клеток. Специфическая сыворотка  нейтрализует вирус и он не оказывает цитопатическое действие на клетки культуры.

        Цветную пробу  ставят с различными типами  клеточных культур. Чаще берут  первичную культуру клеток почки  обезьяны или перевиваемые культуры  клеток. При постановке цветной  реакции необходимо учитывать, что  каждая культура клеток, на которой  ставят реакцию, имеет определённый  уровень метаболизма. Устанавливают  дозу клеток для цветной реакции, то есть то оптимальное количество  клеток, которое должно быть взято  в каждую пробирку.     

в объёме 0,25 мл.

       Титром вируса  по цветной пробе называется  то наибольшее разведение вируса, которое вызывает подавление  метаболической активности клеток  в 50% случаев. В данном примере (табл. 3) титр вируса равен 10-4 (две пробирки красные, две – жёлтые). Количество вируса, содержащееся в объёме 0,25 мл в разведении, равном титру, называется цитопатической дозой (ЦПД50) вируса.

                  Схема титрования вируса методом  цветной пробы    

Ингредиенты опыта (в мл)	№ пробирок
	1	2	3	4	5	6	7	8	9
	Разведения вируссодержащего материала						Контроль клеток
	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	1 доза	½ доза	¼ доза
Вируссодержащий материал	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	-	-	-
Взвесь клеток (1 доза)	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Питательная среда	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,5	0,5	0,5
Вазелиновое масло	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6	0,6
Возможные результаты
Цвет среды в пробирках (красный или жёлтый)	К-4	К-4	К-3   Ж-1	К-2 титр Ж-2	К-1   Ж-3	Ж-4	Ж-4	Ж-2   К-2	К-4
Обозначения:	К-4 – красного цвета 4 пробирки; Ж-3 – жёлтого цвета 3 пробирки