Механизмы выживания бактерий в окружающей сред

В местах с неустойчивой низкой температурой, например в Антарктике, грамотрицательные бактерии, а также грамположительные аэробные и анаэробные спорообразующие организмы встречаются редко. В районах с устойчивой низкой температурой среди бактерий преобладают грамотрицательные палочковидные формы, главным образом Pseudomonas, Vibrio и другие близкие им организмы, обладающие окислительной активностью.

Представители другого класса бактерий, которые  распространены преимущественно в  холодных условиях с неустойчивым температурным  режимом, включают грамположительные  кокки и палочки, относящиеся  главным образом к родам Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Kurthia, Cellulomonas, а также родственные им организмы. Эти бактерии преобладают в антарктических и арктических почвах, озерах, ледниках, льду и снегу, а также в ледяных пещерах и в верхних слоях атмосферы. Эти организмы отличаются тем, что они способны существовать в очень суровых условиях окружающей среды.

Arthrobacter и родственные ему организмы отличаются тем, что они образуют кокковидные клетки во время стационарной фазы роста или в условиях голодания. Некоторые почвенные виды Arthrobacter способны выдерживать длительные периоды голодания in situ, чем и объясняется их широкое распространение в почвах при неустойчивых низких температурах. Один из видов Arthrobacter, обитающий в морях, имеет несколько температурных оптимумов в области роста примерно от 0 до 40°. Вблизи каждого температурного оптимума у этого вида возникают морфологические изменения. Arthrobacter crystallopoietes способен дольше существовать в условиях голодания, чем грамотрицательные бактерии. Длительное выживание этого вида объясняется его способностью к эндогенному метаболизму в отсутствие питательных веществ в окружающей среде.

Обнаружено, что Corynebacterium erythrogenes в отличие от морских психрофилов сохраняет жизнеспособность при температурах, на 3—5°С превышающих максимальную температуру роста.

Различные виды Bacillus сравнительно редко встречаются в полярных районах, так как они не могут прорастать после образования спор. Большинство бактерий этих видов растет при 25—30°С, но способно к спорообразованию при 0°С (Лях С.П., 1976).

2. МЕХАНИЗМЫ ВЫЖИВАНИЯ БАКТЕРИЙ ПРИ ВЫСОКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ

Из широкого набора воздействий, которые окружающая среда может оказывать на организмы, к числу наиболее экстремальных, несомненно, относится повышенная температура. С повышением температуры скорость роста микроорганизмов вначале увеличивается, достигая максимальной, но дальнейшее увеличение температуры ведет к необратимой инактивации клеточных компонентов, прежде всего денатурации белков и нуклеиновых кислот, и гибели клетки. Для большинства организмов характерен весьма незначительный интервал между оптимальной и максимальной температурами.

Для ученых представляет большой интерес изучение микроорганизмов, которые не только выживают, но и размножаются, часто облигатно, при температурах, препятствующих в норме существованию каких бы то ни было форм жизни, вследствие разрушения необходимых для них макромолекул.

Термофилия включает в себя множество молекулярных механизмов и не может быть объяснена каким-либо одним свойством организма. Многочисленные сравнительные физико-химические исследования белков термофильных показали различные механизмы выживания бактерий при высоких температурах (Логинова Л.Г., 1977).

1. Молекулярные механизмы термофилии

Возможность существования  термофилов при высокой температуре  обусловлена следующими особенностями:

1. составом липидных компонентов клеточных мембран, а именно высоким содержанием длинноцепочечных С₁₇—С₁₉ насыщенных жирных кислот с разветвленными цепями;
2. высокой термостабильностью белков и ферментов (последние имеют низкую молекулярную массу и содержат значительное количество ионов кальция);
3. термостабильностью клеточных ультраструктур.

Метаболизм  термофильных микроорганизмов соответствует  их существованию при высоких  температурах. В частности, ферменты отличаются не только высокой термостабильностью, но имеют оптимум активности при существенно более высокой температуре, чем их мезофильные аналоги. Несмотря на то что в целом первичная структура этих ферментов различается лишь немного, точечные аминокислотные замены значительно увеличивают термостабильность вторичной структуры. Термостабильность ДНК обеспечивается суперспирализацией, которая достигается действием специфического фермента — обратной гиразы. Высокой термостабильностью отличаются также рибосомальный аппарат и цитоплазматические мембраны, в которых преобладают насыщенные жирные кислоты. В состав мембран гипертермофильных архей вместо жирных кислот входят специфические липиды — углеводородсодержащие бифитаниловые эфиры (Бухарин О.В., 2005).

2.1.1 Особенность липидов и мембран

Липиды термофильных организмов имеют более высокие температуры плавления, чем липиды нетермофильных. Верхний температурный предел роста бактерий определяется температурой плавления клеточных липидов. Возрастание процентного содержания насыщенных и разветвленных жирных кислот при повышении температуры выращивания микроорганизмов приводит к образованию более устойчивой клеточной мембраны. К главным липидным компонентам экстремальных термофилов относятся жирные кислоты, содержащие 17, 18 и 19 атомов углерода.

Липиды играют важную роль в молекулярном механизме термофилии, а их соединения с углеводами (гликолипиды) способствуют термостабильности мембран. Липиды мембран действуют как изоляторы, препятствующие переносу тепла из внешней среды и предотвращающие таким образом тепловую денатурацию растворимых ферментов.

Липидный состав термофилов зависит от температуры среды, и сохранение физического состояния липидов в мембране при изменении температуры обусловлено изменениями ее липидного состава.

Большой интерес  представляет термофильный ацидофил Thermoplasma acidophilum. Термофилия этого организма, растущего при температуре 59°С, связана с наличием длинных изопреновых цепей липидов. Большая часть содержащихся в мембране нейтральных липидов этерифицирована жирными кислотами, а основная масса глико- и фосфолипидов состоит из длинных цепей с простыми эфирными связями. Аминокислотный состав мембранного белка характеризуется относительно низким уровнем заряженных аминокислот и довольно высоким содержанием остатков цистеина. Высокое содержание кислых аминокислот, является обязательным условием для его роста в термофильных условиях.

Большое количество данных о свойствах мембран и  их регуляции собрано при изучении используемой в качестве модельной системы Escherichia coli. Обнаружено, что мембраны клеток Е. coli во многих отношениях напоминают мембраны термофильных организмов. Об этом говорят следующие особенности мембран E.coli: 1) соотношение насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, накапливающихся в результате подавления биосинтеза липидов, сильно зависит от температуры; например, фракция свободных жирных кислот из клеток, выращенных при 15°С, содержит в 10 раз больше ненасыщенных жирных кислот, чем фракция, полученная из клеток, выращенных при 43°С; 2) при повышении температуры липиды мембраны Е. coli обнаруживают фазовый переход из упорядоченного в неупорядоченное состояние; синтез мембран, содержащих менее одной трети нормального количества таких липидов, приводит к гибели клетки.

Термофилы способны контролировать физические свойства цитоплазматической мембраны, изменяя ее состав в ответ на изменение температуры. Однако этот общий механизм, действует также и у мезофила Е. coli. Таким образом, температурные границы оптимального функционирования мембраны, от которых, несомненно, зависит величина кардинальных температур роста организма, определяются характером химических модификаций веществ, входящих в состав мембраны. Как и в случае термостабильных по своей природе белков, найденных у облигатных и кальдоактивных бактерий, тонкий механизм (или механизмы), участвующий в стабилизации мембраны, остается пока неизвестным. Молекулярная основа регуляции фазового перехода липидов относится к одной из наиболее важных, но еще слабоизученных сторон функционирования мембраны.

2. Термостабильность макромолекул

Выделенные из термофильных организмов макромолекулы обнаруживают большую термостабильность, чем их аналоги из мезофилов. Такая повышенная термостабильность, свойственна всем макромолекулам клетки, включая ферменты главных метаболических путей, ферредоксин, рибосомы и флагеллин.

Большинство белков, выделенных из термофилов, относится  к ферментам, которые гораздо  более стабильны, чем их аналоги  из мезофилов. Классическим примером служит фермент миокиназа, которая сохраняет активность после нагревания при температуре 100°С. У тетрамера авидина в присутствии биотина температура перехода в денатурированное состояние составляет 132°С. У фосфофруктокиназ С. pasteurianum и Е. coli температурный переход происходит приблизительно при 70 и 60°С соответственно. Таким образом, основное различие между белками мезофилов и термофилов заключается в том, что все белки термофилов должны функционировать при температурах развития этих организмов.

Определение температуры максимальной активности ферментов также указывает на их повышенную термостабильность, а потеря всей или большей части активности в результате превышения этой температуры на 10—15°С согласуется с представлением о денатурации белка.

Физико-химическая характеристика белков термофильных микроорганизмов показывает, что они во многом гомологичны соответствующим белкам мезофилов: термофильные белки имеют такое же содержание участков с альфа-спиральной конфигурацией и бета-структурой и такое же число гидрофобных групп, как и аналоги из мезофильных организмов. Но в отличие от белков мезофилов, которые обычно денатурируются при температуре ниже 60°С, термофильные белки при повышении температуры от комнатной до 55 или 60° претерпевают, небольшие конформационные изменения, не сопровождаемые денатурацией.

Термофильные  белки чаще всего содержат большое  число неполярных боковых цепей, поэтому в результате стабилизации дополнительными гидрофобными взаимодействиями возникает повышенная термостабильность  таких участков термофильных белков.

Термофильные  белки более устойчивы к индуцируемой нагреванием агрегации, что следует  из большей устойчивости к тепловой коагуляции цитоплазматических белков термофильных бактерий по сравнению  с аналогичными белками мезофильных  бактерий. Более низкая способность белков к агрегации связана с тенденцией к понижению изоэлектрических точек этих белков и повышению устойчивости их молекул к развертыванию, благодаря чему неполярные участки остаются скрытыми в глубине молекул

Термостабильность белков обусловлена также более низким содержанием цистеина и особенно вспомогательных сульфгидрильных групп, которые обычно располагаются на поверхности белка и поэтому легко подвергаются окислению.

Также известно, что ионы кальция могут стабилизировать ферменты не только у термофильных, но и у мезофильных организмов, и абсолютно необходимы для термостабильности. Образование дополнительных центров связывания кальция в случае термолизина и альфа-амилазы, очевидно, имеет отношение к повышенной термостабильности этих белков. Так, термостабильность термолизина при температурах приблизительно от 50 до 80°С повышается в результате стабилизации одного или двух участков ионами Са2+.

Степень стабильности белков также определяется специфическим  положением в полипептидной цепи определенных аминокислот, поэтому огромное влияние на термостабильность молекулы белка может оказать замена в ней всего лишь одной аминокислоты в процессе различных мутаций генетического материала бактерии (Логинова Л.Г., 1977).

2.1.3 Небелковые стабилизирующие факторы

Некоторые ферменты, выделенные из термофилов, неустойчивы при оптимальной температуре роста данного организма. Это говорит о присутствии в клетках термофилов дополнительных стабилизирующих факторов. Такими факторами могут служить обычные клеточные компоненты, такие, как кофакторы, субстраты, мембраны и внутриклеточная среда, содержащая сильно заряженные макромолекулы, которые обеспечивают необходимую дополнительную стабилизацию ферментов.

Одним из самых наглядных  примеров стабилизации фермента субстратом и модификаторами служит глутаминсинтетаза из В. stearothermophilus Этот фермент быстро теряет активность при 65°С, если в среде отсутствуют глутамат и ионы аммония. Глутаминсинтетаза стабилизируется также модификаторами, действующими по принципу обратной связи, особенно аланином, гистидином и ЦТФ. Для стабилизации внеклеточных гидролаз, например альфа-амилазы и термолизина требуется присутствие кальция. Для термостабильности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы В. coagulans необходимо наличие сильно заряженной окружающей среды.

2.1.4 Высокозаряженные макромолекулы внутри клеток

Термофильные бактерии синтезируют белки, которые обладают присущей им самим термостабильностью. Как отмечалось выше, многие ферменты, выделенные из облигатных или кальдоактивных бактерий, не являются стабильными при оптимальных и (или) максимальных температурах роста, хотя, несомненно, они более термостабильны, чем их мезофильные аналоги. Однако при изучении клеточных стенок факультативного термофила В. coagulans было показано, что отдельные гликолитические ферменты в неочищенных экстрактах этого организма, выращенного при 37 и 55°С, так же лабильны, как и ферменты из мезофильных организмов. Функциональным механизмом термофилии у факультативного термофила В. coagulans служит заряд внутриклеточных макромолекул, что подтверждается наличием у этого организма термолабильной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.