Метанобразующие микроорганизмы

 

1 СИСТЕМАТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ

Метаногены относятся к домену Archaea [1]. В этот домен входят прокариоты, обладающие уникальными физиологическими, биохимическими свойствами и экологией, резко отличными от остальных прокариот. Они отличаются от других бактерий

• составом и первичной структурой рибосомальных 16S и 5S рРНК, а также транспортных РНК;
• составом мембранных липидов и образованием однослойной липидной мембраны;
• составом клеточных стенок (состоят не из пептидогликана, а из других биополимеров – кислых полисахаридов, белков и псевдомуреина);
• отсутствием сложных жизненных циклов, патогенных и паразитических видов, экзоферментов;
• способностью использовать только низкомолекулярные органические соединения;
• жизнеспособностью некоторых видов даже при температуре выше 100^оС
• и др.

У архей имеется целый ряд общих особенностей. Это касается состава клеточной стенки, липидов, аппарата транскрипции и трансляции, простетических групп и коферментов, механизма автотрофной фиксации СО₂, а также способа получения энергии.

Метанобразующие микроорганизмы представлены целым рядом родов[14-15]:

• Methanobacterium,
• Methanococcus,
• Methanosarcina,
• Methanosaeta (Methanothrix),
• Methanocorpusculum,
• Methanobrevibacteria,
• Methanopyrus.

 

Представители:

• Methanobacterium bryantii
• Methanobacterium formicum
• Methanobrevibacter arboriphilicus
• Methanobrevibacter gottschalkii
• Methanobrevibacter ruminantium
• Methanobrevibacter smithii
• Methanocalculus chunghsingensis
• Methanococcoides burtonii
• Methanococcus aeolicus
• Methanococcus deltae
• Methanococcus jannaschii
• Methanococcus maripaludis
• Methanococcus vannielii
• Methanocorpusculum labreanum
• Methanoculleus bourgensis
• Methanoculleus marisnigri
• Methanofollis liminatans
• Methanogenium cariaci
• Methanogenium frigidum
• Methanogenium organophilum
• Methanogenium wolfei
• Methanomicrobium mobile
• Methanopyrus kandleri
• Methanoregula boonei
• Methanosaeta concilii
• Methanosaeta thermophila
• Methanosarcina acetivorans
• Methanosarcina barkeri
• Methanosarcina mazei
• Methanosphaera stadtmanae
• Methanospirillium hungatei
• Methanothermobacter defluvii (Methanobacterium defluvii)
• Methanothermobacter thermautotrophicus (Methanobacterium thermoautotrophicum)
• Methanothermobacter thermoflexus (Methanobacterium thermoflexum)
• Methanothermobacter wolfei (Methanobacterium wolfei)
• Methanothrix sochngenii

Для создания таксономической структуры метаногенов был использован филогенетический подход, основанный на сравнительном анализе нуклеотидных последовательностей 16S рРНК. В соответствии с таким подходом в девятом издании «Определителя бактерий Берги» группа разделена на 3 порядка – Methanobacteriales, Methanococcales, Methanomicrobiales, коэффициент сходства (S_AB) для которых составляет 0,2-0,28. Далее порядки разделены на 6 семейств (S_AB = 0,34-0,36) и 13 родов (S_AB = 0,46-0,51). Число видов достигает более 40. S_AB для них колеблется в пределах 0,55-0,65. О гетерогенности группы можно судить и по нуклеотидному составу ДНК ее представителей (молярное содержание ГЦ-оснований – от 27 до 61%).

В таксономии метаногенов употребляется обозначение Methano- в отличие от аэробных метанокисляющих метанотрофов Methylo-[2]. Важно помнить, что метанобразующие микроорганизмы не являются бактериями, поэтому по отношению к ним это слово не применяется.

 

 

 

 

 

 

 

 

2 СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ МЕТАНОГЕНОВ

2.1 МОРФОЛОГИЯ КЛЕТОК

Метаногены – морфологически разнообразная группа, объединяемая двумя общими для всех ее представителей признаками: облигатным анаэробиозом и способностью образовывать метан.

На сегодняшний  день известно около 40 видов метанобразующих  микроорганизмов, или метаногенов, с различной морфологией[1, 2, 3, 4]:

• палочки Methanobacterium с клеточной стенкой из псевдомуреина (цепи полисахаридов и глюкозамина их клеточной стенки соединены пептидами с иным набором аминокислот, чем у бактерий с муреином);
• кокки Methanococcus с белковой клеточной стенкой;
• плоские угловатые формы Methanohalobium;
• псевдопаренхиматозные агрегаты Methanosarcina с гетерополисахаридом;
• цепи палочек в трубчатых чехлах Methanothrix (Methanosaeta);
• спириллы Methanospirillum с белковой клеточной стенкой.

У некоторых  видов наблюдается тенденция  формировать нити или пакеты. Клетки неподвижные или передвигающиеся  с помощью перитрихиально или полярно расположенных жгутиков. У представителей рода Methanosarcina в клетках обнаружены газовые вакуоли. Для некоторых метаногенов характерна развитая система внутриклеточных элементарных мембран, являющихся результатом разрастания и впячивания в цитоплазму цитоплазматической мембраны и сохраняющих с ней связь.

Формы клеток архей в целом сходны с таковыми эубактерий. Особенность архей − отсутствие сложных многоклеточных форм, мицелиальных и трихомных, достаточно хорошо представленных у грамположительных и грамотрицательных эубактерий.

 

2.2 СТРОЕНИЕ КЛЕТОК

По тонкому  строению клетки, выявляемому с помощью  электронного микроскопа, археи принципиально  не отличаются от эубактерий и ближе к грамположительной их ветви. Прокариотная организация архей проявляется в отсутствии у них ядра и характерных для эукариот органелл, окруженных мембраной. Хромосомная ДНК организована в виде нуклеоида, т.е. расположена непосредственно в цитоплазме и имеет вид электроннопрозрачной зоны, заполненной нитями ДНК. В цитоплазме некоторых архей обнаружены газовые вакуоли и запасное вещество гликоген, присущие многим эубактериям.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2.3 СТРОЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ

Метаногены составляют обособленную группу микроорганизмов. Они отличаются от других микроорганизмов не только типом метаболизма, но и некоторыми признаками, касающимися состава клеточных структур[4] .

У этой группы архей обнаружены клеточные стенки трех типов:

• состоящие из псевдомуреина,
• построенные из белковых глобул,
• гетерополисахаридной природы.

Недавно описан микоплазмподобный метаноген, выделенный в род Methanoplasma, не имеющий клеточной стенки и фильтрующийся через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм [3] .

У одних  видов клеточная стенка выглядит как толстый гомогенный слой, у  других – тонкий, структурированный. У некоторых нитчатых форм поверх клеточной стенки расположен чехол, объединяющий несколько клеток. Многие виды имеют жгутики и ворсинки эубактериального типа.

Хотя  клетки архей структурно относятся  к прокариотному типу, многие макромолекулы, входящие в их состав (липиды, полисахариды, белки), уникальны и не найдены ни у эубактерий, ни у эукариот. Одно из существенных отличий архей связано с химическим составом клеточных стенок, в которых не обнаружен характерный для эубактерий пептидогликан. В составе последнего в качестве обязательного компонента присутствует N-ацетилмурамовая кислота. Отсюда и часто употребляющееся его название муреин (от лат. "murus" − стенка). Вместо него у ряда архей из группы метанобразующих найден другой пептидогликан, получивший название псевдомуреина (рис. 1). Его гликановый остов построен из N-ацетилглюкозамина и N-ацетилталозаминуроновой кислоты, а пептидные фрагменты – только из L-аминокислот. Последовательность аминокислот пептидного хвоста псевдомуреина отличается от таковой эубактериального пептидогликана. Кроме того, аминосахара гликановой цепи псевдомуреина соединены не с помощью бета-1,4-, а через бета-1,3-гликозидные связи. Отсутствие у архей муреина привело к их устойчивости к пенициллину и некоторым другим антибиотикам, ингибирующим синтез пептидогликана эубактерий.

Рис. 1.Структура псевдомуреина метаногенных архей.

Г − N-ацетилглюкозамин; Т − N-ацетилталозаминуроновая кислота; глу − глутаминовая кислота; ала − аланин; лиз − лизин.

 

Под электронным  микроскопом клеточные стенки такого типа, окрашивающиеся положительно по Граму, выглядят как однородный слой толщиной 15-40 нм, ничем морфологически не отличающийся от клеточной стенки грамположительных эубактерий.

Описаны метанобразующие археи с очень  толстой (до 500 нм) аморфной клеточной  стенкой, дающей положительную реакцию  по Граму, построенной исключительно из кислого гетерополисахарида, в составе которого обнаружены галактозамин, нейтральные сахара и уроновые кислоты. Наличие у этих микроорганизмов положительного окрашивания по Граму может служить указанием на то, что оно определяется не химическим составом клеточной стенки, а ее строением. (Вероятно, все гораздо сложнее. Описаны эубактерий, имеющие типичную грамположительную клеточную стенку, но окрашивающиеся по Граму отрицательно, и наоборот).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3 Геномная организация метаногенов

Существенные отличия выявлены у архей в строении генома. Прежде всего, исследователи обратили внимание на то, что именно в группе архей наименьший геном среди свободноживущих форм прокариот: у изученных метанобразующих архей − порядка 1*10⁹ Да (для сравнения молекулярная масса генома Е. coli − 2,5*10⁹ Да).

Особенность генома архей – наличие  многократно повторяющихся нуклеотидных последовательностей, а в генах, кодирующих белки, тРНК и рРНК, – интронов, что характерно для организации генетического материала эукариот. У некоторых архей обнаружены основные гистоноподобные белки, связанные с ДНК. Функция их предположительно заключается в обеспечении определенной упаковки ДНК в нуклеоиде.

Помимо хромосомной ДНК в  клетках архей обнаружены типичные для эубактерий фаги, плазмиды, мигрирующие элементы.

Существование механизмов переноса генетической информации с помощью фагов и  плазмид позволяет предполагать, что археи должны каким-то образом защищать собственный генетический материал от чужеродного. У эубактерий эта проблема решена с помощью системы рестрикции-модификации. У эукариот такой системы нет, они выработали иные механизмы генетической изоляции. Найдено, что археи обладают системой рестрикции-модификации, аналогичной эубактериальной.

 

 

 

 

4.1 Условия роста метаногенов

Будучи  биологическим процессом, метаногенез протекает только в определенных условиях, наиболее благоприятных для микрофлоры. В биотехнологии получения биогаза из органических отходов должны учитываться особенности метаногенеза. Большое влияние оказывают температура, рН, состав среды и наличие в ней ингибиторов (мономеры, кислоты), концентрация и размеры твердых частиц, гидродинамические условия в ферментационной среде и другие факторы.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4.2 Температура

Метаногенные микроорганизмы проявляют свою жизнедеятельность в пределах температур 0-70^оС. Большинство метаногенов имеют температурный оптимум для роста в области 30-40^оС с нижней границей около 15^оС, то есть являются мезофилами, но есть виды, у которых оптимальная зона сдвинута в сторону более низких (25^оС) или высоких (55-65^оС) температур. Психрофильный метаноген Methanococcoides burtonii имеет минимальную температуру роста –2,5^оС, а максимальную – +28^оС. Среди метаногенов много термофилов, в том числе экстремальных, развивающихся в гидротермах при температуре до 98^оС (Methanopyrus), 85^оС (Methanothermus, Methanocaldococcus), 70^оС (Methanobacterium thermoautotrophicum) [2]. Недавно выделен экстремально термофильный микроорганизм Methanothermus fervidus, растущий при 55-97^оС (оптимум 80^оС) [3]. Культуры метаногенов хорошо сохраняются при 4^оС, но замораживание при −20^оС переносят хуже.

Температура оказывает наиболее существенное влияние на газовыделение [10] . Выявлено, что оптимальная температура для максимального метанообразования составляет 54-56^оС. При температуре ниже 6^оС метаногенез подавляется полностью.

По отношению  к температуре выделяют 3 вида метаногенеза [5] :

1. психрофильный (низкотемпературный), протекающий при 10-14^оС;
2. мезофильный (среднетемпературный) с наиболее благоприятным интервалом температур 35-37^оС;
3. термофильный (высокотемпературный), идущий при 50-55^оС

Каждый  из перечисленных процессов осуществляется особым комплексом микробов, приспособленных  к определенной температуре. Микроорганизмы могут работать в психрофильных (не выше 20^оС), мезофильных (20-45^оС) или термофильных (50-65^оС) условиях. Термофильный метаногенез является наиболее продуктивным, но его осуществление требует искусственного подогрева, поэтому на практике чаще используют мезофильный процесс. Термофильные микроорганизмы имеют высокие скорости реакции, но часто получаемая при этом выгода недостаточно велика, чтобы возместить стоимость дополнительной тепловой энергии, необходимой для поддержания более высоких температур. Кроме того, в таких условиях существует мало разновидностей, которые могут влиять на способность системы адаптироваться к различным субстратам или ингибирующим соединениям. Несмотря на то, что термофильный процесс обеспечивает исчезновение бактерий группы кишечной палочки, что очень важно с точки зрения обезвреживания отходов, большинство установок в настоящее время работает в мезофильном режиме, что экономически выгодно и допускает существование большого числа микроорганизмов.