Методы исследования в цитологии

 

 

 

 

Мурманский  государственный технический университет

 

 

 

 

                                                                                                                                           Кафедра биологии

 

 

Доклад  на тему:

"Методы  исследования в цитологии"

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выполнил:

Студентка 1-го курса

Технического  факультета

Кафедры Биология

Серебрякова Лада Вячеславовна

 

 

Проверил:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Мурманск 2001       

 

План:

1. Что изучает  цитология.

2. Представление  о том, что организмы состоят  из клеток.

3. Методы исследования, применяемые в цитологии.

4. Фракционирование  клеток.

5. Радиоавтография.

6. Определение  продолжительности некоторых стадий  клеточного цикла методом радиоавтографии.

 

 

Цитология –  наука о клетке. Из среды других биологических наук она выделилась почти 100 лет назад. Впервые обобщенные сведения о строении клеток были собраны в книгу Ж.-Б.   Карнуа  «Биология клетки», вышедшей в 1884 году. Современная цитология изучает строение клеток, их функционирование как элементарных живых систем: исследуются функции отдельных клеточных компонентов, процессы воспроизведения клеток, их репарации, приспособление к условиям среды и многие другие процессы, позволяющие судить об общих для всех клеток свойствах и функциях. Цитология рассматривает также особенности строения специализированных клеток. Другими словами, современная цитология – это физиология клетки. Цитология тесно сопряжена с научными и методическими достижениями биохимии, биофизики, молекулярной биологии и генетики. Это послужило основанием для углубленного изучения клетки уже с позиций этих наук и появления некой синтетической науки о клетке – биологии клетки, или клеточной биологии. В настоящее время термины цитология и биология клетки совпадают, так как их предметом изучения является клетка с ее собственными закономерностями организации и функционирования. Дисциплина «Биология клетки» относится к фундаментальным разделам биологии, потому что она исследует и описывает единственную единицу всего живого на Земле – клетку.

 

Длительное и пристальное изучение клетки как таковой привело к формулированию важного теоретического обобщения, имеющего общебиологическое значение, а именно к появлению клеточной теории. В XVII в. Роберт Гук, физик и биолог, отличавшийся большой изобретательностью, создал микроскоп. Рассматривая под своим микроскопом тонкий срез пробки, Гук обнаружил, что она построена из малюсеньких ничем не заполненных ячеек, разделенных тонкими стенками, которые, как это нам теперь известно, состоят из целлюлозы. Он назвал эти маленькие ячейки клетками. В дальнейшем, когда другие биологи начали исследовать под микроскопом растительные ткани, оказалось, что маленькие ячейки, обнаруженные Гуком в мертвой иссохшей пробке, имеются и в живых растительных тканях, но у них они не пустые, а содержат каждая по маленькому студенистому тельцу. После того, как микроскопическому исследованию подвергли животные ткани, было установлено, что они также состоят из мелких студенистых телец, но  что эти тельца лишь в редких случаях отделены друг от друга стенками. В результате всех этих исследований в 1939 г. Шлейден и Шванн независимо друг от друга сформулировали клеточную теорию, гласящую, что клетки представляют собой элементарные единицы, из которых в конечном счете построены все растения и все животные. В течение какого-то времени двоякий смысл слова клетка еще вызывал некоторые недоразумения, но затем он прочно закрепился за этими маленькими желеобразными тельцами.

 

Современное представление  о клетке тесно связано с техническими достижениями и усовершенствованиями методов исследования. Помимо обычной световой микроскопии, не утратившей своей роли, в последние несколько десятилетий большое значение приобрели поляризационная, ультрафиолетовая, флюоресцентная, фазовоконтрастная микроскопия. Среди них особое место занимает электронная микроскопия, разрешающая способность которой позволила проникнуть и изучить субмикроскопическую и молекулярную структуру клетки. Современные методы исследования позволили вскрыть детальную картину клеточной организации.

Каждая клетка состоит из ядра и цитоплазмы, отделенных друг от друга и от внешней среды оболочками. Компонентами цитоплазмы являются: оболочка, гиалоплазма, эндоплазматическая сеть и рибосомы, аппарат Гольджи, лизосомы, митохондрии, включения, клеточный центр, специализированные органеллы.

Часть организма, выполняющая какую-то особую функцию, называют органом. Любой орган –  легкое, печень, почка, например – имеет  каждый свою особую структуру, благодаря  которой он играет определенную роль в организме. Точно так же в цитоплазме имеются особые структуры, своеобразное строение которых дает им возможность нести определенные функции, необходимые для метаболизма клетки; эти структуры называют органеллами («маленькими органами»).

Выяснение природы, функции  и распределения органелл цитоплазмы стало возможным лишь после развития методов современной биологии клетки. Наиболее полезными в этом  отношении оказались: 1) электронная микроскопия; 2) фракционирование клеток, с помощью которого биохимики могут выделять относительно чистые фракции клеток, содержащие определенные органеллы, и изучать, таким образом, отдельные интересующие их метаболические реакции; 3) радиоавтография, сделавшая возможным непосредственное изучение отдельных метаболических реакций, протекающих в органеллах.

 

Метод, с помощью которого органеллы выделяют из клеток, называют фракционированием.  Этот метод оказался очень плодотворным, дав биохимикам возможность выделять разные органеллы  клетки в относительно чистом виде. Он позволяет, кроме того, определять химический состав органелл и содержащиеся в них ферменты и на основании получаемых данных делать выводы об их функциях в клетке. В качестве первого шага клетки разрушают путем гомогенизации в какой-нибудь подходящей среде, которая обеспечивает сохранность органелл и предотвращает  их агрегацию. Очень часто для этого используют раствор сахарозы. Хотя митохондрии и многие другие клеточные органеллы остаются при этом неповрежденными, такие мембранные переплетения, как эндоплазматический ретикулум, а также плазматическая мембрана, распадаются на фрагменты. Однако образующиеся фрагменты мембран нередко замыкаются сами на себя, в результате чего получаются округлые пузырьки различных размеров.

На следующем этапе клеточный  гомогенат подвергают ряду центрифугирований, скорость и продолжительность которых всякий раз возрастает; этот процесс называется дифференциальным центрифугированием. Разные органеллы клетки осаждаются на дне центрифужных пробирок при различных скоростях центрифугирования, что зависит от размеров, плотности и формы органелл. Образующийся осадок можно отобрать и исследовать. Быстрее всех осаждаются такие крупные и плотные структуры, как ядра, а для осаждения более мелких и менее плотных структур, таких, как пузырьки эндоплазматического ретикулума, требуются более высокие скорости и более длительное время. Поэтому при низких скоростях центрифугирования ядра осаждаются, а другие клеточные органеллы остаются в суспензии. При более высоких скоростях осаждаются митохондрии и лизосомы, а при длительном центрифугировании и очень высоких скоростях в осадок выпадают даже такие мелкие частицы, как рибосомы. Осадки можно исследовать с помощью электронного микроскопа, чтобы определить чистоту полученных фракций. Все фракции до некоторой степени загрязнены другими органеллами. Если тем не менее удается добиться достаточной чистоты фракций, то их подвергают затем биохимическому анализу, чтобы определить химический состав и ферментативную активность выделенных органелл.

Сравнительно недавно был создан другой метод фракционирования клеток – центрифугирование в градиенте плотности; при этом центрифугирование производят в пробирке, в которой предварительно наслаивают друг на друга растворы сахарозы все возрастающей концентрации, а следовательно, и возрастающей плотности. При центрифугировании содержащиеся в гомогенате органеллы располагаются в центрифужной пробирке на тех уровнях, на которых находятся растворы сахарозы, соответствующие им по плотности. Этот метод дает биохимикам  возможность разделять органеллы одинаковых размеров, но разной плотности (рис. 1.).

 

 

 

Радиоавтография – сравнительно новый  метод, безмерно расширивший возможности  как световой, так и электронной  микроскопии. Это в высшей степени  современный метод, обязанный своим  возникновением развитию ядерной физики, которое сделало возможным получение радиоактивных изотопов различных элементов. Для радиоавтографии необходимы, в частности, изотопы тех элементов, которые используются клеткой или могут связываться с веществами, используемыми клеткой, и которые можно вводить животным или добавлять к культурам в количествах, не нарушающих нормального клеточного метаболизма. Поскольку радиоактивный изотоп (или помеченное им вещество) участвует в биохимических реакциях так же, как его нерадиоактивный аналог, и в то же время испускает излучение, путь изотопов в организме можно проследить с помощью различных методов обнаружения радиоактивности. Один из способов обнаружения радиоактивности основан на ее способности действовать на фотопленку подобно свету; но радиоактивное излучение проникает сквозь черную бумагу, используемую для того, чтобы защитить фотопленку от света, и оказывает на пленку такое же действие, как свет.

Чтобы на препаратах, предназначенных для изучения с  помощью светового или электронного микроскопов, можно было обнаружить излучение, испускаемое радиоактивными изотопами, препараты покрывают в темном помещении особой фотоэмульсией, после чего оставляют на некоторое время в темноте. Затем препараты проявляют (тоже в темноте) и фиксируют. Участки препарата, содержащие радиоактивные изотопы, воздействуют на лежащую над ними эмульсию, в которой под действием испускаемого излучения возникают темные «зерна». Таким образом, получают радиоавтографы (от греч. радио – лучевидный, аутос – сам и графо – писать).

Вначале гистологи  располагали лишь несколькими радиоактивными изотопами; так, например, во многих ранних исследованиях с применением  радиоавтографии использовался  радиоактивный фосфор. Позднее стали  использовать значительно больше таких  изотопов; особенно широкое применение нашел радиоактивный изотоп водорода – тритий.

Радиоавтография имела и имеет до сих пор  очень широкое применение для  изучения того, где и как в организме  протекают те или иные биохимические  реакции.

Химические соединения,  меченые радиоактивными изотопами, которые используются для исследования биологических процессов, называют предшественниками. Предшественники – это обычно вещества, подобные тем, которые организм получает из пищи; они служат строительными блоками для построения тканей и включаются в сложные компоненты клеток и тканей таким же образом, как в них включаются немеченые строительные блоки. Компонент ткани, в который включается меченый предшественник и который испускает излучение, называется продуктом.

Клетки, выращиваемые в культуре, хотя и принадлежат к одному и тому же типу, в любой данный момент времени будут находиться на разных стадиях клеточного цикла, если не принять специальных  мер для синхронизации их циклов. Тем не менее, путем введения в клетки  тритий-тимидина и последующего изготовления радиоавтографов можно определить продолжительность различных стадий цикла. Время наступления одной стадии – митоза – можно определить и без меченого тимидина. Для этого выборку клеток из культуры держат под наблюдением в фазово-контрастном микроскопе, который дает возможность непосредственно следить за течением митоза и устанавливать его сроки. Продолжительность митоза обычно равна 1 ч, хотя в клетках некоторых типов он занимает до 1.5 ч.

Определение продолжительности  G 2-периода.

Для определения  продолжительности  G 2–периода применяют  метод, известный под названием импульсной метки:  к культуре клеток добавляют меченый тимидин, а спустя короткое время заменяют культуральную среду свежей, с тем, чтобы предотвратить дальнейшее поглощение клетками меченого тимидина. При этом метку включают только в те клетки, которые в течение кратковременного пребывания в среде с  тритий-тимидином находились в S-периоде клеточного цикла. Доля таких клеток невелика и лишь небольшая часть клеток получит метку. Кроме того, все клетки, включающие метку, будут находиться в интерфазе – от клеток, едва вступивших в S-период, до таких, которые почти закончили его за время воздействия тритий-тимидина. В пробе, взятой сразу после удаления меченого тимидина, метка содержится только в интерфазных ядрах, принадлежащих клеткам, которые в период воздействия метки находились в S-периоде; те же клетки, которые в этот период находились в состоянии митоза, остаются немечеными.

Если затем  продолжать отбирать из культуры пробы через определенные промежутки времени и изготовлять для каждой последовательной пробы радиоавтограф, то наступит момент, когда метка начнет появляться в митотических d-хромосомах. Метки будут включаться во все те клетки, которые в период наличия в среде тритий-тимидина находились в S-периоде, причем среди этих клеток будут как только что вступившие в S-период, так и почти закончившие его. Совершенно очевидно, что эти последние первыми среди меченых клеток проделают митоз и, следовательно, в их митотических хромосомах обнаружится метка. Тем самым промежуток между 1) временем, когда из культуры был удален меченый тимидин, и 2)  временем  появления меченых митотических хромосом будет соответствовать продолжительности G 2–периода клеточного цикла.

Определение продолжительности S-периода.

Поскольку клетки, находящиеся в момент введения в  среду метки в самом конце S-периода, первыми вступят в митоз, то, следовательно, в тех клетках, у которых S-период начинается непосредственно перед удалением метки, меченые митотические хромосомы появятся в последнюю очередь. Поэтому, если бы нам удалось определить промежуток между временем вступления в митоз клеток, помеченных первыми, и клеток, помеченных последними, мы установили бы продолжительность S-периода. Однако, хотя время, когда впервые появляются меченые митотические хромосомы, установить легко, время вступления в митоз клеток, помеченных последними, определить невозможно (этому препятствует очень большое количество меченых делящихся клеток в последних пробах). Поэтому продолжительность S-периода приходится определять другим способом.

При исследовании радиоавтографов  последовательных проб клеток, отбираемых через одинаковые промежутки времени, обнаруживается, что доля клеток, несущих  метку в своих митотических хромосомах, постепенно возрастает, пока  мечеными не окажутся буквально все делящиеся клетки. Однако, по мере того как клетки одна за другой завершают митоз, они превращаются в меченые интерфазные клетки. Первыми завершают митоз те из меченых клеток, которые вступили в него первыми; и соответственно из клеток с мечеными митотическими хромосомами последними завершают митоз те, которые вступили в него позже всех. Поскольку продолжительность митоза всегда одинакова, то, следовательно, если бы мы могли определить промежуток между: 1) временем окончания митоза в клетках, включивших метку первыми, и 2) временем окончания митоза в клетках, включивших метку последними, мы установили бы продолжительность S-периода. Продолжительность S-периода нетрудно установить, определив промежуток между: 1) моментом времени, когда 50% митотических клеток в культуре несут метку, и 2) моментом времени, после которого культура уже не содержит 50% меченых клеток.