Методы определения диоксинов

Метод газовой хроматографии  незаменим в металлургии, энергетике, биологии, медицине, в пищевой промышленности, используется для управления технологическими процессами.

В аналитической практике в основном применяют метод газожидкостной хроматографии. Его преимущества перед  газо-адсорбционным связаны главным  образом с возможностью широкого выбора неподвижных жидких фаз различной химической природы, а также с высокой чистотой и однородностью жидкостей. Термостойкость адсорбентов дает возможность также проводить разделения высококипящих соединений. 

Недостатком газо-адсорбционного метода является нелинейность изотерм адсорбции, приводящая к несимметричности пиков. 

 

 

1.2. Масс-спектрометрическое определение

 

Масс-спектрометрическое окончание занимает принципиальное место во всех процедурах, связанных  с определением следовых количеств  диоксинов. В масс-спектрометрии молекулы определяемых соединений ионизируются каким-либо способом в вакууме или в атмосфере газа.

При хромато-масс-спектрометрическом определении диоксинов часто  применяется квадрупольная масс-спектрометрия  низкого разрешения. Ионизация осуществляется двумя путями - электронным ударом (c образованием положительных ионов) и, поскольку многие органические соединения не образуют молекулярных ионов, химически (с образованием положительных или отрицательных ионов) [13].

Ионизация электронным ударом (EI) осуществляется в ионных источниках. При соударении электронов, испускаемых катодом, с молекулами образца последние ионизируются. Положительно заряженные молекулярный и осколочные ионы выводятся из ионизационной камеры, ускоряются и разделяются в анализаторе. Этот вид ионизации наиболее всего подходит для определения ТХДД и ТХДФ (условия: потенциал ионизации - до 70 эВ, 250oС). Предел обнаружения 1-10 пг для ТХДД и ТХДФ и 10-50 пг для ОХДД и ОХДФ. Он достигается с использованием одно- (selective ion monitoring, SIM) и многоионных (MID) детекторов. Полный масс-спектр требует 0,1-1 нг вещества.

При химической ионизации  первоначально ионизируется газ-реагент (Аr, H2O, CH4, O2 и т.д.), находящийся при  давлении 0,2-2 мм рт.ст. Возникающие ионы реагируют с анализируемыми молекулами с образованием квазимолекулярных ионов, главным образом типа MH+. Образование этих ионов происходит при более мягких условиях, чем в случае EI, так что они оказываются более устойчивыми, а спектры - более простыми.

Сочетание масс-спектрометрии низкого разрешения в режиме селективного детектирования избранных ионов (SIM) с ГХ высокого разрешения позволяет достичь пределов обнаружения 1-10 пг в различных матрицах.

Дополнительное повышение  селективности и чувствительности обеспечивает применение масс-спектрометрической техники высокого разрешения [14]. В частности, при разрешении 5000-10000 с использованием техники EI и SIM достигается чувствительность порядка 10-200 фг, которая улучшается для ПХДД и ПХДФ при последовательном переходе от Cl4- к Cl8-производным [15]. Сочетание ГХ высокого разрешения и масс-спектрометрии высокого разрешения в настоящее время стало наиболее распространенным методом определения ПХДД и ПХДФ в наиболее сложных матрицах - объектах окружающей среды, продуктах питания, биопробах [16,17].

Для количественного  масс-спектрометрического определения  ПХДД и ПХДФ используется масс-спектрометрическое детектирование (масс-фрагментография). Результат получается в результате измерения площадей сигналов и сравнения их с градуировочными графиками внешних стандартов и изотопно меченных внутренних стандартов. Внутренние стандарты вводятся до экстракции. Применение меченых стандартов, обеспечивающих идентификацию отдельных изомеров и высокую точность определения диоксинов, особенно важно в случаях, когда их концентрация в образцах находится на уровне ppt и ниже. Во избежание ошибочных результатов при определении в образцах ПХДД и ПХДФ разработаны специальные критерии.

Один из эффективных  подходов к масс-спектрометрическому определению следовых количеств ПХДД и ПХДФ в сложных смесях - комбинирование двух масс-спектрометров (тандемная масс-спектрометрия, метод MS-MS). Первый используется для генерирования и разделения ионов, второй служит для их идентификации и определения. Методом тандемной масс-спектрометрии успешно определяли ТХДД на фоне тысячекратного избытка ПХБ.

Достоинства Масс-спектрометрическое определение

Говоря о достоинствах масс-спектрометрии, следует прежде всего отметить чувствительность, экспрессность, информативность и надёжность метода. За последнее время масс-спектрометрия претерпела потрясающий технологический подъём, позволяющий применять её для белков, пептидов, углеводов, ДНК, лекарств и многих других биологически активных молекул. Благодаря различным способам ионизации масс-спектрометрия стала незаменимым инструментом для биохимических исследований.Масс-спектрометр определяет массу молекулы, измеряя отношение массы к заряду её иона (m/z). Ионы генерируются при потере или получении заряда нейтральными частицами. После образования ионы электростатически направляются в анализатор массы, где они разделяются соответственно своему m/z и детектируются. Результатом ионизации молекул, разделения ионов и детектирования ионов является спектр, по которому можно определить молекулярную массу и некоторую информацию о строении вещества, провести идентификацию вещества.

Недостатки метода: мол. ионы образуются лищь у 20% орг. соед.; метод применим только для определения легколетучих термически стабильных соед.; в значениях полного ионного тока на ионы с большими значениями m/z, дающие информацию о мол. массе и наличии функц. групп, приходится меньшая часть; отрицательно заряженные ионы, имеющие большое значение в структурном анализе, образуются в очень небольшом кол-ве и ограниченным числом орг. соединений.

Множественные формы  цитохрома Р450

Цитохром Р450 обнаруживается во всех организмах, начиная от бактерий. Полагают, что в процессе эволюции этот фермент появился для конверсии  инертных углеводородов окружающей среды до продуктов, используемых с энергетической и пластической целью, либо для удаления токсичных гидроперекисей у примитивных организмов, использующих кислород в клеточном дыхании. В результате процессов дупликации, конверсии, мутации генов образовалось множество изоформ цитохрома Р450, осуществляющих окислительный, восстановительный метаболизм стероидов, жирных кислот, ретиноидов, желчных кислот, биогенных аминов, лейкотриенов, а также экзогенных соединений, в том числе лекарств, загрязняющих агентов из окружающей среды, химических канцерогенов.

В настоящее время известно, что цитохромы Р450 млекопитающих  представляют собой структурно и  функционально различные изоферменты. Они кодируются суперсемейством генов. В 1987г. была разработана классификация Р450, основанная на дивергентной эволюции и гомологии нуклеoтид/аминокислотной последовательностей. Суперсемейство разделено на семейства, подсемейства и индивидуальные гены. Цитохромы Р450, имеющие более 40% гомологии аминокислотных последовательностей объединяют в одно семейство, а имеющие более 59% гомологии – в одно подсемейство. При составлении номенклатуры не учитывалась каталитическая активность цитохромов, поэтому члены различных подсемейств могут иметь перекрывающуюся субстратную специфичность.

Независимо от структуры и хромосомной локализации, цитохромы P450 подразделяют на конститутивные и индуцибельные. Конститутивные изоформы Р450 постоянно продуцируются клеткой, независимо от условий роста. В отличие от конститутивных форм, экспрессия индуцибельных ферментов может контролироваться химическими соединениями. Специфическая индукция отдельных форм Р450 – одно из важнейших свойств этих ферментов, приобретенных в процессе эволюции.

2-я фаза метаболизма  ксенобиотиков. 

Ко второй фазе биотрансформации ксенобиотиков (II фаза) относятся реакции глюкуронидации, сульфатирования, ацетилирования, метилирования, конъюгации с глютатионом (синтез меркаптуровой кислоты) и конъюгация с аминокислотами, такими как глицин, таурин, глутаминовая кислота. Кофакторы этих реакций реагируют с функциональными ферментами 1-й фазы. За исключением метилирования и ацетилирования, реакции 2-й фазы приводят к значительному увеличению гидрофильности ксенобиотика, что способствует их экскреции из организма. Большинство ферментов 2-й фазы локализовано в цитозоле, кроме уридиндифосфоглюкуронозилтрансфераз (УДТ), которые являются микросомальными. Реакции 2-й фазы обычно протекают намного быстрее, чем реакции 1-й фазы, катализируемые цитохромом Р-450. Поэтому скорость элиминирования ксенобиотика в большой степени зависит от скорости, с которой протекает реакция 1-й фазы.

Способность цитохромов Р450 к индукции

   Одним из важнейших свойств компонентов монооксигеназной системы, в частности цитохрома Р-450, является способность к индукции под действием внешнего стимула, в роли которого могут выступать ксенобиотики, определенные физические воздействия, стресс. В отдельных случаях экзогенные вещества индуцируют ферменты (в том числе цитохромы Р-450) своего метаболизма, что важно иметь в виду при приеме лекарств, побочным действием которых является индукция ферментов собственного метаболизма. Феномен индукции цитохромов Р450 является важнейшей составляющей адаптивного ответа на чужеродные соединения, попадающие в клетку. Это приводит к усилению детоксификационной функции организма с последующим выведением ксенобиотика. Хроническое введение крысам барбитуратов постепенно уменьшало время сна от этих препаратов из-за усиления их метаболизма. Отсюда было сделано заключение, что данные метаболические изменения вызваны индукцией определенных форм цитохрома Р450. Процесс индукции цитохромов Р450 синтетическими или природными соединениями зарегистрирован у млекопитающих, птиц, рыб,беспозвоночных, растениях, дрожжах и бактериях. Все это свидетельствует о биологической важности этого явления.

    Некоторые цитохромы P-450 являются высоко индуцибильными: например, экспрессия Р-

450 1А1 может  увеличиваться более чем в  сто раз в печени и многих  других тканях под действием  2,3,7,8,-тетрахлородибензо-р-диоксина, 3-метилхолантрена или других

полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Экспрессия Р-450 2Е1 в печени возрастает под воздействием этанола, ацетона, изониазида, имидазола и других веществ, а 

экспрессия  цитохромов подсемейства 4А в печени и почках вызывается клофибратом и другими пероксисомальными пролифераторами. Эффективными индукторами Р-450 подсемейства 3А являются макролидные антибиотики, синтетические стероиды (например, дексаметазон), и фенобарбитал (ФБ). ФБ вместе с большой группой структурно различных химических соединений, может также увеличивать экспрессию индивидуальных членов подсемейств подсемейств цитохромов Р-450 2А, 2В и 2С как у лабораторных животных, так и у людей (например, индукция цитохромов Р-450 2С под действием ФБ в культурах человеческих гепатоцитов). Параметры индукции некоторых цитохромов Р450 приведены в табл. 1.

Табл.1. Индукция цитохромов Р450 различными соединениями

Форма Р450	Типичные индукторы	Механизм первичной индукции
1А1	Диоксин (ТХДД), 3-метилхолантрен	Активация транскрипции лиганд-активируемых Ah-рецептором
1А2	3-метилхолантрен	Стабилизация мРНК
2В1/2	Фенобарбитал	Активация транскрипции под действием CAR-рецептора
2Е1	Этанол, ацетон, изониазид	Стабилизация белка
3А1	Дексаметазон	Активация транскрипции под действием PXR-рецептора
3А1	Триацетилолиндомицин	Стабилизация белка

 

Как видно из таблицы, ряд цитохромов Р450 активируется при участии специфичных рецепторов. Лишь для Р-450 1А1 и, соответственно, Ah-рецептора  известен детальный механизм действия. Для остальных Р450, как правило, идентифицирован специфичный рецептор, но механизм действия к настоящему времени детально не описан (соответствующие ссылки – в (табл 1) Кроме транскрипционного механизма индукции для цитохромов Р450 известны также посттранскрипционные (стабилизация мРНК) и пострансляционные (стабилизация белка, модификация фермента) механизмы. Последние характерны для цитохромов Р450 1А2, 2Е1 и 3А1.