Митотические хромосомы

В настоящее время установлено, что в основе строения хромосомы лежит хроматин -- сложный комплекс ДНК, белков, РНК и других веществ, входящих в хромосому (строение хроматина мы подробно рассмотрели в главе 1). Предполагается, что в хромосому человека входит одна гигантская молекула ДНК, молекулы РНК, гистоны и кислые белки, различные ферменты, фосфолипиды, металлы Са2+, Mg2+ и некоторые другие вещества. Способ укладки и взаимного расположения молекул этих химических соединений в хромосоме пока не известен. Длинная нить ДНК не может располагаться в хромосоме беспорядочно. Существует предположение, что нить ДНК упакована закономерным образом и связана с белками.

Ф. Арриги и соавторы (1971) установили, что уникальные последовательности занимают более 56% ДНК хромосом человека, высокоповторяющиеся -- 12,4 %, промежуточные повторы -- 8 %. Общее количество повторяющихся генов в ДНК хромосомы человека равно 28%. Число хромосом у человека длительное время оставалось невыясненным. Дело в том, что определить количество хромосом у млекопитающих, особенно у человека, было трудно. Хромосомы оказались маленькими, весьма многочисленными, плохо поддавались подсчету. При фиксации клетки они сливались в комки, что затрудняло определение истинного числа хромосом. Поэтому первые исследователи не могли точно и правильно подсчитать количество хромосом в клетках человека. Называлось разное количество хромосом -- от 44 до 50.

Обычно хромосомы в клетках наблюдают во время митоза на стадии метафазной пластинки. В интерфазном ядре хромосомы в световой микроскоп не видны. В 1912 г. Г. Винивартер, изучая хромосомы в сперматогониях и оогониях половых желез человека, удаленных во время операции, установил, что мужской набор хромосом (кариотип) содержит 47 хромосом, а женский -- 48. В 1922 г. Т. Пайнтер повторил исследования Винивартера и установил, что мужской и женский кариотипы содержат по 48 хромосом, но женский отличается от мужского только двумя хромосомами. У женщин находится 2 большие половые хромосомы, а у мужчины одна большая Х-хромосома и одна маленькая К-хромосома. В последующие годы эту точку зрения поддерживали и другие ученые. П.И. Живаго и А.Г. Андреа (1932) предложили первую классификацию хромосом в зависимости от их длины. Так как хромосомы очень близко располагаются одна около другой и их очень трудно исследовать, то и в последующие годы точное число хромосом у человека служило предметом споров и дискуссий. Однако постепенно было достигнуто согласие между исследователями по этому вопросу, и в течение 30 лет большинство цитогенетиков считало, что у человека диплоидное число хромосом равно 48, а гаплоидное -- 24. Усовершенствованные методы изучения хромосом позволили получить более точные сведения о количестве хромосом в клетках у человека, а также выявить аномалии нормального кариотипа, ответственные за некоторые уродства. Особенно плодотворным оказались два метода:

1. Обработка культуры  клеток алкалоидом колхицином, который  ведет к накоплению делящихся  клеток на стадии метафазы;

2. Обработка клеток слабыми  растворами солей, вызывающими набухание, расправление хромосом, что облегчает  их исследование.

В 1956 г. шведские цитологи Дж. Тийо и А. Леван изготовили культуры клеток из тканей легких, взятых у абортированных человеческих эмбрионов и, используя усовершенствованную методику обработки клеток, получили необычайно четкие препараты, в которых ясно было видно 46 хромосом.

Несколькими месяцами позднее Ч. Форд и Дж. Хаммертон в Англии установили, что диплоидные предшественники половых клеток в семенниках мужчин (сперматогонии) также имеют по 46 хромосом, а гаплоидные (сперматоциты 1-го деления) -- по 23 хромосомы.

После этого были изучены многие клетки из разных органов и тканей человека и везде нормальное число хромосом оказалось равным 46.

Женский кариотип отличается от мужского только одной половой хромосомой. Остальные 22 пары одинаковы у мужчин и женщин. Эти 22 пары хромосом называются аутосомами. Нормальный кариотип состоит из 44 аутосом (22 пары) и двух половых хромосом -- XX у женщин и XY у мужчин, т. е. женский кариотип имеет две большие половые хромосомы, а мужской -- одну большую и одну маленькую.

В половых клетках человека находится одинарный (гаплоидный) набор хромосом -- 23, а в соматических клетках -- двойной (диплоидный) набор -- 46. Эти открытия стимулировали дальнейшее изучение хромосом. Были разработаны методы исследования хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови и на других объектах. В настоящее время хромосомы относительно легко исследуют в лимфоцитах периферической крови. Венозную кровь помещают в специальную питательную среду, добавляют фитогемаглютинин, который стимулирует клетки к делению, и помещают на 72 ч. в термостат. За 6 ч. до конца инкубации сюда добавляют колхицин, который задерживает процесс деления клеток на стадии метафазной пластинки. Затем культуру помещают в гипотонический раствор NaCl, в котором клетки набухают, что приводит к легкому разрыву оболочек ядра и переходу хромосом в цитоплазму. После этого препараты окрашивают ядерными красителями, в частности ацетоорсеином, и рассматривают их в световом микроскопе с иммерсией.

Под микроскопом учитывают общее количество хромосом, фотографируют их, затем из фото вырезают ножницами каждую хромосому и наклеивают на чистый лист бумаги в ряд, начиная от самой большой (первой) хромосомы и кончая самой маленькой (двадцать второй) и половой Y-хромосомой. Люминесцентная методика позволяет быстро и просто проводить массовые исследования с целью выявления больных с различными типами хромосомных аномалий. Совокупность количественных (число хромосом и их размеры) и качественных (морфология хромосом) признаков диплоидного набора единичной клетки обозначается термином «кариотип». Строение хромосом изменяется в зависимости от стадии деления клеток (профазы, метафазы, анафазы, телофазы). Уже в профазе митоза видно, что хромосома образована двумя взаимно переплетающимися нитями одинакового диаметра -- хроматидами. В метафазе хромосома уже спирализована, и две ее хроматиды ложатся параллельно, разделенные узкой щелью. Каждая хроматида состоит из двух полухроматид. В результате митоза хроматиды материнской хромосомы становятся сестринскими хромосомами, а полухроматиды -- их хроматидами. В основе хроматид лежат хромонемы -- так называют более тонкие нити ДНП, состоящие из белка и нуклеиновых кислот.

В интерфазе (промежуток между двумя делениями клеток) хроматин тесно связан с ядерными мембранами и ядерным белковым матриксом. Он образует также большие участки деспирализованных нитей ДНП.

Затем постепенно хроматин спирализуется, образуя типичные метафазные хромосомы. Размеры их варьируют от 2 до 10 микрон.

В настоящее время интенсивно исследуются структурные особенности аутосом и половых хромосом (на клетках костного мозга, лимфоцитах, фибробластах, клетках кожи, регенерирующей печени).

В хромосомах выявлены структуры, названные хромомерами. Хромомер -- это спирализованный участок хромонемы. Промежутки между хромомерами представлены хромонемными нитями. Расположение хромомеров на каждой хромосоме строго фиксировано, наследственно детерминировано.

Хромомер -- сравнительно крупная генетическая единица, сравнимая по длине с хромосомой кишечной палочки. Строение и функция хромомера -- основная загадка современной генетики. Предполагают, что некоторые хромомеры -- это один генетический локус, где есть один структурный ген и много генов регуляторных. Возможно, в других хромомерах располагается несколько структурных генов.

Хромонемы и хромомеры окружены неокрашивающимся веществом -- матриксом. Полагают, что матрикс содержит дезоксирибонуклеиновую и рибонуклеиновую кислоты, белки.

Определенные участки хромосом образуют ядрышки. Ядрышки -- это более или менее деспирализованные участки хромосом, окруженные продуктами деятельности генов (рибосомы, частицы РНК и т. п.). Здесь идет синтез рибосомальной РНК, а также осуществляются определенные этапы формирования рибосом. В нем синтезируется большая часть РНК клетки.

В метафазной хромосоме различают еще несколько образований: центромеру, два плеча хромосомы, теломеры и спутник.

Центромерный (meros -- по-гречески, часть) участок хромосомы -- это неокрашивающийся разрыв в хромосоме, видимый на препарате хромосом. Центромера содержит 2--3 пары хромомер, имеет сложное строение. Предполагают, что она направляет движение хромосомы в митозе. К центромерам прикрепляются нити веретена.

Теломеры -- специальные структуры на концах хромосом -- также имеют сложное строение. В их состав входит несколько хромомер. Теломеры предотвращают концевое присоединение метафазных хромосом друг к другу. Отсутствие теломеров делает хромосому «липкой» -- она легко присоединяется к другим фрагментам хромосом.

Одни участки хромосомы называются эухроматиновыми, другие -- гетерохроматиновыми.

Эухроматиновые районы хромосом -- это генетически активные участки, они содержат основной комплекс функционирующих генов ядер. Потеря даже мельчайшего фрагмента эухроматина может вызвать гибель организма. Гетерохроматиновые районы хромосом -- обычно сильно спирализованы и, как правило, генетически мало активны. В гетерохроматине находится ядрышковый организатор. Потеря даже значительной части гетерохроматина часто не приводит организм к гибели. Гетерохроматиновые участки хромосомы реплицируются позднее, чем эухроматиновые. Следует помнить, что эухроматин и гетерохроматин -- это не вещество, а функциональное состояние хромосомы.

Если расположить фотографии гомологичных хромосом по мере возрастания их размеров, то можно получить так называемую идиограмму кариотипа. Таким образом, идиограмма -- это графическое изображение хромосом. На идиограмме пары гомологов располагаются рядами в порядке убывающего размера.

У человека на идиограмме среди 46 хромосом различают три типа хромосом в зависимости от положения в хромосоме центромер:

1. Метацентрические -- центромера занимает центральное положение в хромосоме, оба плеча хромосомы имеют почти одинаковую длину;

2. Субметацентрические -- центромера располагается ближе к одному концу хромосомы, в результате чего плечи хромосомы разной длины.

Классификация хромосом человека по размеру и расположению центромера

3. Акроцентрические -- центромера находится у конца хромосомы. Одно плечо очень короткое, другое длинное. Хромосомы не очень легко отличать одну от другой. Цитогенетики с целью унификации методов идентификации хромосом на конференции в 1960 г. в г. Денвере (США) предложили классификацию, учитывающую величину хромосом и расположения центромер. Патау в том же году дополнил эту классификацию и предложил разделить хромосомы на 7 групп. Согласно этой классификации, к первой группе А относятся крупные 1, 2 и 3 суб- и акроцентрические хромосомы. Ко второй группе В -- крупные Субметацентрические пары 4--5. К третьей группе С относятся средние субакроцентрические (6--12 пары) и Х-хромосома, которая по величине находится между 6 и 7 хромосомами. К группе Д (четвертой) относятся средние акроцентрические хромосомы (13, 14 и 15 пары). К группе Е (пятой)-- мелкие Субметацентрические хромосомы (16, 17 и 18 пары). К группе F (шестой) мелкие метацентрические (19 и 20 пары), а к группе G (седьмой) -- самые мелкие акроцентрические хромосомы (21 и 22 пары) и мелкая акроцентрическая половая Y-хромосома (табл. 4).

Существуют и другие классификации хромосом (Лондонская, Парижская, Чикагская), в которых развиты, конкретизированы и дополнены положения Денверской классификации, что в конечном итоге облегчает идентификацию и обозначение каждой из хромосом человека и их частей.

Акроцентрические хромосомы IV группы (Д, 13--15 пары) и группы VII (G, 21--22 пары) на коротком плече несут маленькие дополнительные структуры, так называемые сателлиты. В некоторых случаях эти сателлиты являются причиной сцепления хромосом между собой при делении клеток в мейозе, вследствие чего происходит неравномерное распределение хромосом. В одной половой клетке оказывается 22 хромосомы, а в другой -- 24. Так возникают моносомии и трисомии по той или иной паре хромосом. Фрагмент одной хромосомы может присоединиться к хромосоме другой группы (например, фрагмент 21 или 22 присоединяется к 13 или 15). Так возникает транслокация. Трисомия 21-й хромосомы или транслокация ее фрагмента являются причиной болезни Дауна.

Внутри семи этих групп хромосом на основании лишь внешних различий, видимых в простой микроскоп, провести идентификацию хромосом почти невозможно. Но при обработке хромосом акрихини притом и при помощи ряда других методов окраски их можно идентифицировать. Известны различные способы дифференциальной окраски хромосом по Q-, G-, С-технике (А.Ф.Захаров, 1973) (рис. 27). Назовем некоторые методы идентификации индивидуальных хромосом человека. Широко применяются различные модификации так называемого метода Q. Например, метод QF -- с использованием флюорохромов; метод QFQ -- с использованием акрихина; метод QFH -- с использованием специального красителя фирмы «Хекст» № 33258, выявляющего повторяющиеся последовательности нуклеотидов в ДНК хромосом (сателлитную ДНК и т. п.). Мощным средством изучения и индивидуальной характеристики хромосом являются модификации трипсинового метода GT. Назовем, например, GTG-метод, включающий обработку хромосом трипсином и окраску красителем Гимза, GTL-метод (обработка трипсином и окраска по Лейтману).