Морфологические и цитологические особенности

По ряду признаков подобны миксобактериям флексибактерии - обитатели пресной и морской воды. Клетки представителей рода Flexibacter имеют вид длинных гибких нитей толщиной менее 1 мкм, способных к скользящему движению.

Физиологические особенности

Myxococcus xanthus — миксобактерии, которые были обнаружены в верхнем слое почвы. Там они питаются органическими веществами самой почвы, а также другими микроорганизмами путем секреции гидролитических ферментов и антимикробных веществ. В присутствии большого числа питательных веществ формируют совместно питающиеся колонии. Клетки, образующие колонию, передвигаются в сторону потенциальной жертвы (колонии другого вида) распознавая изменения эластических и механических свойств поверхности, вызванные жизнедеятельностью колонии-жертвы. После чего Myxococcus окружает жертву, и осуществляется переваривание. В ответ на снижение количества питательных веществ в среде неструктурированная масса вегетативных клеток Myxococcus xanthus реорганизуется в плодовые тела, в которых образуются споры необходимые для переживания неблагоприятных условий.

Myxococcus xanthus — хемоорганотрофы, строгие  аэробы. Имеют вегетативные клетки  с утонченными концами и образуют  сферические или овальные микроцисты. Клетки Myxococcus представляют собой  палочки, которые передвигаются  посредством скольжения.

Клетки M. xanthus передвигаются двумя способами: по одиночке (A-motility), и группами (S-motility). A-motility осуществляется благодаря слизи, выделяемой по реактивному принципу, из Nls структур гомологичных таковым у некоторых цианобактерий, осуществляющим такой тип передвижения. S-motility обеспечивается посредством сокращения пилей четвертого типа (Tfp). Это полярно расположенные структуры, в основном представленные на одном полюсе клетки. Клетки двигаются по субстрату периодически останавливаясь и меняя направление движения на противоположное. Предполагается, что в момент остановки происходит деградация пилей на одном полюсе и синтез пилей на другом de novo. Tfp зависимое движение опирается на два последовательно происходящих события: синтез пилей, присоединение пилей к полисахаридным фибриллам гликокортекса соседней клетки, после чего начинается совместное передвижение (S от social).

Spormann и Kaiser обнаружили MglA белок, который  контролирует переключение типов  движения с одного полюса на другой. Было продемонстрировано, что мутанты синтезирующие уменьшенные количества MglA обладают повышенной скоростью такого переключения. Помимо этого, контроль за переключениями осуществляет Frz система. Она состоит из FrzCD, метилсвязывающего белка; FrzE, гистидиновой протеинкиназы; FrzA, FrzB — адаптерных белков; FrzF, метилтрансферазы; FrzG, метилэстеразы. У мутантов с выключенной Frz системой наблюдается повышенное число переключений [20, с. 121].

Образование плодового тела в условиях голодания — это сложный процесс относящийся к категории плотность зависимых. На ранних этапах образования агрегаций ведущую роль играет фактор А, затем фактор С. С сигнал становится важным на 3 час голодания. В низких концентрациях с сигнал вызывает сползание клеток: они начинают двигаться в одном направлении. Более высокие концентрации вызывают образование плодовых тел и споруляцию. Образование плодовых тел включает несколько этапов: сползание клеток, формирование клеточных агрегатов, формирование плодовых тел, преобразование вегетативных клеток центральной части плодовых тел в споры.

 С сигнал, воздействуя на Frz систему, ускоряет движение клеток и  уменьшает частоту переключений, что делает возможным образование  клеточных агрегатов. При S-движении  клетки соединяются друг с другом, образуя цепочки. Если одна из клеток цепочки меняет направление движения, то вся цепочка разрушается.

За синтез С сигнала отвечает csgА ген. Мутанты по этому гену не способны образовывать плодовые тела. Способность восстанавливается при совместном развитии со штаммом дикого типа. CsgA белок существует в двух формах: полноразмерный 25-kD белок (p25), гомологичный короткоцепочечной алкогольдегидрогеназе, и 17-kD белок (p17). Оба белка ассоциированы с внешней мембраной. P17 представляет собой концевой участок p25. Рекомбинантный p17 с отсутствующим N-концевым участком, ответственным за связывание NAD+, имеет С-сигнальную активность. Эти данные доказывают, что активность белка не связана с алкогольдегидрогеназной активностью.

Миксобактерии имеют относительно крупные клетки шириной 0,6-2,0 мкм и длиной  1,2-10 мкм двух морфологических типов: 1) тонкие гибкие палочки с более или менее суженными концами и 2) относительно толстые палочки цилиндрической формы с закругленными концами. Клетки миксобактерий обычно окрашены в желтый, оранжевый или красный цвет за счет каротиноидных пигментов.

Миксобактерии передвигаются путем скольжения по твердой поверхности и способны также проникать в субстрат, продвигаясь внутри, например, плотных 1,2–1,5 % агаровых гелей. В результате скользящего движения клеток колонии миксобактерий разрастаются распространяются по поверхности субстрата и поэтому называются швармы (т.е. это колонии миксобактерий). Внутри шварма клетки обычно распределены неравномерно, большая часть их находится концентрируясь в радиальных тяжах, а иногда в массивных складках по периферии шварма. В условиях голодания клетки скапливаются и агрегируют в определенных участках шварма, образуя крупные глобулярные или гребневидные массы, которые затем дифференцируются в структуры, которые называются плодовые тела.

Плодовые тела варьируют в размерах от 100 до 600 мкм и хорошо заметны благодаря яркой окраске и блестящей поверхности. Плодовые тела имеют разную форму: от микроскопического бугорка до сложных древоподобных структур, они могут располагаться концентрическими кругами либо радиальными тяжами. Внутри созревающего плодового тела вегетативные клетки превращаются в покоящиеся миксоспоры. Они устойчивы к высыханию и довольно устойчивы к нагреванию: выживают при температуре 58–60 ºС на протяжении 10–60 мин. Миксоспоры могут иметь сферическую или овальную (например, у представителей родов Myxococcus, Nannocystis и др.) и палочковидную (например, у представителей родов Cystobacter, Polyangium, Stigmatella и др.) форму.

Миксобактерии – облигатные аэробы. Большинство из них мезофиллы. Все представители – хемоорганотрофы, способные использовать самые разнообразные органические вещества в качестве источников энергии и углерода. В зависимости от источников питания различают бактериолитические и целлюлозолитические виды.

К бактериолитическим относятся миксобактерии, входящие в род Myxococcus. Представители этого рода синтезируют различные экзоферменты, которые могут разрушать клетки бактерий, дрожжей и других микроорганизмов и использовать полученные вещества в своих метаболических процессах. в качестве источников энергии и углерода. Такой тип взаимоотношений между микроорганизмами относится к хищничеству.

Целлюлозолитические виды содержит род Polyangium, так как его представители способны гидролизовать целлюлозу. Следует отметить, что некоторые миксобактерии способны синтезировать в значительных количествах стеролы (например, бактерии рода Nannocystis).

Методы выделения и изучения

В лабораторной практике для учета микроорганизмов в почве используют разные методы, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки.

Наиболее полно отражает численность клеток в почве метод прямого подсчета под микроскопом, требующий высокой квалификации исследователя. Для подсчета зародышей методом Виноградского в модификации Шульгиной на предметное стекло наносят определенный объем суспензии, готовят из него мазок на определенной площади, затем мазок фиксируют, красят и подсчитывают под микроскопом количество клеток микроорга-низмов. Фиксация препарата не дает возможности выявить- количество жизнеспособных клеток. В какой-то мере этот недостаток можно устранить при использовании метода флуоресцентной микроскопии.

Значительно меньшее число зародышей обнаруживается при посеве почвенной суспензии на жидких средах методом предельных разведений, но он более удобен и требует меньших затрат времени.

Широко применяется метод Коха для учета почвенных микроорганизмов. При этом почвенную суспензию из определенного разведения высевают на плотных питательных средах. Этот метод дает возможность убедиться в наличии живых зародышей, выявить их качественный состав и выделить чистые культуры. Этим методом выявляется больше зародышей, чем методом предельных разведений на жидких средах.

Для определения относительной заселенности той или иной группы микроорганизмов в почве используют метод обрастания ими комочков почвы. В зависимости от физиологической группы микроорганизмов используют соответствующие элективные питательные среды.

Группы микроорганизмов, учитываемые на жидких средах (методом предельных разведений). Аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмы количественно можно учесть на среде Имшенецкого и Солнцевой, содержащей (в %): NaN03—0,25; К2НРО4— 0,1; MgS04—0,03; NaCl—0,1; СаС12—0,01; СаС03—0,5; добавлять мел не обязательно.

По 5 мл среды разливают в пробирки, а в качестве источника углерода опускают полоску фильтровальной бумаги (длиной 7—10 см), не содержащей крахмала (реакция с раствором Люголя). Полоска на 4—5 см должна выступать над средой [ 5, с. 83].

Аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмы. Для определения качественного состава и относительной оценки населенности их в почве используют гелевые пластины или пластины из «голодного» агара.

На пластинах помещают кружок стерильной фильтровальной бумаги, увлажненной стерильной средой Виноградского (стр. 105) или средой Гатчинсона, затем по фильтровальной бумаге раскладывают (дотрафарету) 50 комочков почвы диаметром 1—2 мм.

Аэробные целлюлозоразлагающие микроорганизмы наиболее полно выявляются методом почвенных пластинок.

Почву обогащают соединениями калия и азота (2 мл 1,5%-ного раствора KNO3 на 50—60 г почвы). Обогащенную навеску размешивают, увлажняют и помещают в чашку Петри, на дно которой предварительно кладут стерильные обеззоленные    фильтры     или     фильтровальную     бумагу.       На       поверхность почвенной пластинки также накладывают кружок фильтровальной бумаги и плотно прижимают его к поверхности пластинки. Чашки с пластинками инкубируют во влажной камере. Срок инкубации варьирует в зависимости от свойств почвы. Для дерново-подзолистой почвы этот срок можно ограничить несколькими неделями, в черноземе срок инкубации должен быть увеличен.

Результаты опыта оценивают по степени разложения бумаги. В дерново-подзолистой почве целлюлозоразлагающие микроорганизмы представлены обычно    грибами,   в   черноземе   —     миксобактериями.  

Для   выделения миксобактерий из почвы используется следующий метод.

Чашка Петри наполняется почвой, которая увлажняется до полной влагоемкости. В почву вносят автоклавированный кроличий помет. Инкубируют при 30°. Через 10 дней на комочках помета под микроскопом видные плодовые тела миксобактерий. Используется также метод накопительных культур. В этом случае применяют среду Гетчинсона (г/л): КН2S04 - 0,1; NaCI - 0,1; CaCl2 -0,1; FeCI3 - 0,1; MgS04 . 7H20 - 0,3; NaNO3 - 2,5, дистиллированная вода. Среду наливают в колбочки или пробирки, куда в качестве источника углерода помещают фильтровальную бумагу: В колбочки опускают складчатый бумажный фильтр, в пробирки — полоски фильтровальной бумаги.

После стерилизации колбочки и пробирки засевают комочками почвы.

Условия    накопительной       культуры     для   целлюлозоразлагающих микроорганизмов можно создать, используя метод комочков. На поверхность пластинок    кремнекислого геля или голодного агара накладывают кружки фильтровальной    бумаги,    смоченные      раствором   Гетчинсона.    Затем   на поверхность бумаги раскладывают 25 комочков почвы. Чашки инкубируют в термостате при 25—30° во влажной камере и наблюдают за развитием микроорганизмов. Через несколько недель подсчитывают процент комочков, вокруг которых наблюдается разложение клетчатки, и составляют характеристику развивающихся микроорганизмов на основе их микроскопического исследования.

Аэробные целлюлозоразрушающие микроорганизмы на гелевых пластинах учитывают на 8—10-й день инкубации. Кроме общего подсчета обросших комочков почвы, отдельно определяют процент комочков, обросших бактериями, актиномицетами и грибами.

Среда Гетчинсона (в г на 1 л дистиллированной воды): NaN03—2,5; КН2Р04—1,0; MgS04-7H20— 0,3; NaCl—0,1; СаС12—0,1; FeCl3—0,01; pH среды доводят до 7,2 добавлением 20% раствора Na2C03.

ВЗЯТИЕ СРЕДНЕЙ ПОЧВЕННОЙ ПРОБЫ И ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА К МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ

Среднюю почвенную пробу получают смешиванием отдельных образцов, количество которых зависит от микрорельефа (ровный, волнистый, склон и т. д.) и площади. Н. К. Красильников (1966) рекомендует с площади 100 м2 брать пробу из трех точек, с более 100 м2— из пяти, с гектара и более — из 15. При исследовании пашни пробы берут с глубины всего пахотного слоя, снимая верхний двухсантиметровый слой, при изучении микрофлоры почвенного профиля — по генетическим горизонтам (снизувверх).

Почвенный образец берут стерильным буром, стерильной лопатой и стерильным ножом в заранее приготовленную стеклянную широкогорлую стерильную банку, закрывающуюся корковой пробкой, обернутой стерильной ватой, или в стерильные полиэтиленовые мешки, или в мешки из пергаментной бумаги. На пакеты или банки наклеивают этикетки с указанием места взятия пробы, горизонта и других необходимых сведений.