Мутации

     Мутации – это изменения в ДНК клетки. Возникают под действием ультрафиолета, радиации (рентгеновских лучей) и т.п. Передаются по наследству, служат материалом для естественного отбора. отличия от модификаций

     Генные мутации – изменение строения одного гена. Это изменение в последовательности нуклеотидов: выпадение, вставка, замена и т.п. Например, замена А на Т. Причины – нарушения при удвоении (репликации) ДНК. Примеры: серповидноклеточная анемия, фенилкетонурия.

     По характеру  изменений в составе гена различают следующие типы мутаций:

• Делеции — утрата сегмента ДНК размером от одного нуклеотида до гена.
• Дупликации — удвоение или повторное дублирование сегмента ДНК от одного нуклеотида до целых генов.
• Инверсии — поворот на 180° сегмента ДНК размером от двух нуклеотидов до фрагмента, включающего несколько генов.
• Инсерции — вставка фрагментов ДНК размером от одного нуклеотида до целого гена.
• Трансверсии — замена пуринового основания на пиримидиновое или наоборот в одном из кодонов.
• Транзиции — замена одного пуринового основания на другое пуриновое или одного пиримидинового на другое в структуре кодона.

     По последствиям  генных мутаций их классифицируют  на нейтральные, регу-ляторные и  динамические, а также на миссенс- и нонсенс-мутации. Нейтральная мутации (молчащая мутация) — мутация не имеет фенотипи-ческого выражения (например, в результате вырожденности генетического кода). Миссенс-мутация — замена нуклеотида в кодирующей части гена — приводит к замене аминокислоты в полипептиде. Нонсенс-мутация — замена нуклеотида в кодирующей части гена — приводит к образованию кодона-терминатора (стоп-кодона) и прекращению трансляции. Регуляторная мутация — мутация в 5'- или З'-нетранслируемых областях гена, такая мутация нарушает экспрессию гена. Динамические мутации — мутации, обусловленные увеличением числа три-нуклеотидных повторов в функционально значимых частях гена. Такие мутации могут привести к торможению или блокаде транскрипции, приобретению белковыми молекулами свойств, нарушающих их нормальный метаболизм.

     Естественный отбор — основной эволюционный процесс, в результате действия которого в популяции увеличивается число особей, обладающих максимальной приспособленностью (наиболее благоприятными признаками), в то время, как количество особей с неблагоприятными признаками уменьшается. В свете современной синтетической теории эволюции естественный отбор рассматривается как главная причина развития адаптаций, видообразования и происхождения надвидовых таксонов. Естественный отбор — единственная известная причина адаптаций, но не единственная причина эволюции. К числу неадаптивных причин относятся генетический дрейф, поток генов и мутации.

     Изоляция в популяционной генетике — исключение или затруднение свободного скрещивания.

     Географическая изоляция — это пространственная, территориальная, климатическая изоляция, возникающая вследствие прекращения миграции (потока генов) и панмиксии географическими преградами. В качестве географических преград могут выступать океанические и морские проливы, реки для сухопутных организмов и суша - для водных.

     Биологическая  изоляция — это биологические барьеры межпопуляционному скрещиванию. Известны два механизма репродуктивной изоляции: презиготические и постзиготические. Презиготические механизмы препятствуют скрещиванию индивидов различных популяций и тем самым исключают возможность появления гибридного потомства. В презиготической изоляции выделяют следующие формы:

• Экологическая изоляция — изоляция вследствие экологического разобщения. Популяции живут на общей территории, но в различных местах обитания и поэтому друг с другом не встречаются. В горах обычны два вида традесканции: один на скалистых вершинах, другой — в тенистых лесах.
• Временная изоляция — изоляция вследствие разновременности половой активности или цветения. Максимум кладок серебристой чайки приходится на последнюю треть апреля, а у восточной клуши - не раньше середины мая.
• Этологическая изоляция — неспаривание вследствие различий в сексуальном поведении (в ухаживании, пении, танцах, свечении, демонстрациях). Брачная окраска, поведение и сигналы самцов воспринимаются только самками того же вида. У млекопитающих важную роль играют химические сигналы.
• Механическая изоляция — безрезультатность спаривания вследствие разного строения половых органов. Межвидовые спаривания у дрозофилы приводят к травмам и даже к смерти партнеров. Шалфеи различаются строением цветка и поэтому опыляются разными видами пчел.
• Гаметическая изоляция — отсутствие таксиса между гаметами или же гибель микрогамет в половых путях самки или в рыльцах цветков. Постзиготическая репродуктивная изоляция возникает вследствие:

1. нежизнеспособность гибридов: зигота развивается в гибрид, обладающий пониженной жизнеспособностью (гибнет зародыш на разных стадиях развития, гибнет молодой организм, гибрид не достигает половой зрелости);

2. стерильность гибридов: гибриды жизнеспособны, но они не образуют полноценных гамет;
3. вырождение гибридов — разрушение гибридов: гибриды дают потомков, жизнеспособность и плодовитость которых понижена.

     Значение изоляции: нарушает панмиксию, усиливает в изолятах инбридинг, закрепляет генотипическую дифференцировку, усиливает генотипическую дифференцировку, ведет к формированию нескольких популяций из одной исходной.

     Дрейф  ге́нов или гене́тико-автомати́ческие проце́ссы — явление ненаправленного изменения частот аллельных вариантов генов в популяции, обусловленное случайными статистическими причинами.

     Один из  механизмов дрейфа генов заключается  в следующем. В процессе размножения  в популяции образуется большое число половых клеток — гамет. Большая часть этих гамет не формирует зигот. Тогда новое поколение в популяции формируется из выборки гамет, которым удалось образовать зиготы. При этом возможно смещение частот аллелей относительно предыдущего поколения.

     Инбри́динг (англ. inbreeding, от in — «внутри» и breeding — «разведение») — скрещивание близкородственных форм в пределах одной популяции организмов (животных или растений). Термин «инбридинг» обычно используется в отношении животных, а для растений более распространён термин «инцухт» (нем. Inzucht); этот термин также часто используется при описании взаимоотношений между людьми — например, в биографиях.

     Инцест является ярко выраженной формой инбридинга, когда скрещивание происходит между особями, связанными прямым родством. Предельная форма инбридинга — самооплодотворение, когда организм оплодотворяет сам себя.

     Методы ДНК-технологии используют для выяснения локализации в той или иной хромосоме мутантного гена, ответственного за происхождение определённых форм наследственной патологии. Так как ген представляет собой участок ДНК, а мутация генов - повреждение первичной структуры ДНК (под мутацией понимают все изменения в последовательности ДНК, независимо от их локализации и влияния на жизнеспособность индивида), то, зондируя препараты метафазных хромосом больного с наследственным заболеванием, удаётся установить локализацию патологического гена. Методы молекулярной генетики создают возможности для диагностики болезней на уровне изменённой структуры ДНК, они позволяют выяснять локализацию наследственных нарушений. Молекулярно-генетические методы могут выявить мутации, связанные с заменой даже одного-единственного основания.

     Важнейший этап идентификации  гена - его выделение. ДНК может  быть изолирована из любого  типа тканей и клеток, содержащих  ядра. Этапы выделения ДНК включают: быстрый лизис клеток, удаление  с помощью центрифугирования фрагментов клеточных органелл и мембран, ферментативное разрушение белков и их экстрагирование из раствора с помощью фенола и хлороформа, концентрирование молекул ДНК путём преципитации в этаноле.

     В генетических лабораториях  ДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови, для чего у пациента забирают 5-20 мл венозной крови в стерильную пробирку с раствором антикоагулянта (гепарин). Затем отделяют лейкоциты и проводят их обработку по изложенным выше этапам.

     Следующий этап подготовки  материала к исследованию - «разрезание» ДНК на фрагменты в участках со строго специфической последовательностью оснований, которое осуществляют с помощью бактериальных ферментов - рестрикционных эндонуклеаз (рестриктаз). Рестриктазы узнают специфические последовательности из 4-6, реже 8-12 нуклеотидов в двухцепочечной молекуле ДНК и разделяют её на фрагменты в местах локализации этих последовательностей, называемых сайтами рестрикции. Количество образующихся рестрикционных фрагментов ДНК определяется частотой встречаемости сайтов рестрикции, а размер фрагментов - характером распределения этих сайтов по длине исходной молекулы ДНК. Чем чаще расположены сайты рестрикции, тем короче фрагменты ДНК после рестрикции. В настоящее время известно более 500 различных типов рестриктаз бактериального происхождения, и каждый из этих ферментов узнаёт свою специфическую последовательность нуклеотидов. В дальнейшем сайты рестрикции могут быть использованы в качестве генетических маркёров ДНК. Образовавшиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по длине путём электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле, а тем самым может быть определена их молекулярная масса. Обычно для выявления ДНК в геле используется специфическое окрашивание (чаще бромидом этидия) и просмотр геля в проходящем свете ультрафиолетовой области спектра. Места локализации ДНК имеют красную окраску. Однако у человека при обработке ДНК несколькими рестриктазами образуется так много фрагментов различной длины, что их не удаётся разделить с помощью электрофореза, то есть не удаётся визуально идентифицировать отдельные фрагменты ДНК на электрофореграмме (получают равномерное окрашивание по всей длине геля). Поэтому для идентификации нужных фрагментов ДНК в таком геле используют метод гибридизации с мечеными ДНК-зондами.

     Любой одноцепочечный  сегмент ДНК или РНК способен  связываться (гибридизироваться) с  комплементарной ему цепью, причём  гуанин всегда связывается с  цитозином, аденин с тимином. Так  происходит образование двухцепочечной  молекулы. Если одноцепочечную копию клонированного гена пометить радиоактивной меткой, получится зонд. Зонд способен отыскивать комплементарный сегмент ДНК, который затем легко идентифицировать с помощью радиоавтографии. Радиоактивный зонд, добавленный к препарату растянутых хромосом, позволяет локализовать ген на определённой хромосоме: с помощью ДНК-зонда можно идентифицировать определённые участки при саузерн-блоттинге. Гибридизация происходит, если тестируемый участок ДНК содержит нормальный ген. В случае, когда присутствует ненормальная последовательность нуклеотидов, то есть соответствующие структуры хромосомы содержат мутантный ген, гибридизация не произойдёт, что позволяет определить локализацию патологического гена.

     Для получения ДНК-зондов  используют метод клонирования генов. Сущность метода состоит в том, что фрагмент ДНК, соответствующий какому-либо гену или участку гена, встраивают в клонирующую частицу, как правило, бактериальную плазмиду (кольцевая внехромосомная ДНК, присутствующая в клетках бактерий и несущая гены устойчивости к антибиотикам), и затем бактерии, имеющие плазмиду со встроенным человеческим геном, размножают. Благодаря процессам синтеза в плазмиде удаётся получить миллиарды копий человеческого гена или его участка.

     В дальнейшем полученные копии ДНК, меченные радиоактивной меткой или флюорохромами, используют в качестве зондов для поиска комплементарных последовательностей среди исследуемого пула молекул ДНК.

     В настоящее время  существует множество разновидностей  методов с использованием ДНК-зондов для диагностики генных мутаций.

     Блоттинг — общее название методов молекулярной биологии по переносу определённых белков или нуклеиновых кислот из раствора, содержащего множество других молекул, на какой-либо носитель (мембрану из нитроцеллюлозы, PVDF или нейлона) в целях последующего анализа. В одних случаях молекулы предварительно подвергаются гель-электрофорезу, в других — переносятся непосредственно на мембрану. После блоттинга молекулы визуализируются посредством различных методов:

• Окрашивание (например, окрашивание белков серебром).
• Авторадиографическая визуализация.
• Специфическое маркирование с помощью иммунохимических методов или гибридизации.