Полимеразная цепная реакция. (ПЦР) ДНК - зонды

 

 

 

 

 

 

 

 

Реферат

по дисциплине «Ветеринарная микробиология»

на тему: «Полимеразная цепная реакция.(ПЦР) ДНК - зонды»

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Караваево, 2015

Содержание:

1. Полимеразная цепная  реакция

2.Разновидноси ПЦР

3. Принципы ПЦР диагностики 

4.Порядок процедуры

5. Стадии полимеразной цепной реакции

6. Применение ПЦР

7. Список литературы

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция – метод, позволяющий провести многократное увеличение (амплификацию) количества определенных молекул ДНК в анализируемом образце (в том числе в биологическом материале или чистой культуре).

Главные преимущества ПЦР как диагностического метода в микробиологии – очень высокая чувствительность, позволяющая обнаружение крайне малых концентраций возбудителей в образцах, а такжерегулируемая специфичность, позволяющая обнаруживать или идентифицировать возбудителей на родовом, видовом или субвидовом уровне. Основной недостаток ПЦР вытекает из его крайне высокой чувствительности – образы очень легко загрязнить ДНК из положительного контроля, другого образца или продукта ПЦР, что приведет к ложноположительной реакции. Это накладывает жесткие ограничения на условия, в которых производится смешивание ПЦР и работа с готовыми продуктами ПЦР.

 

 

Проведение ПЦР. Готовится реакционная смесь, содержащая следующие компоненты:

1. Выделенную ДНК из исследуемого образца,
2. Буферный раствор,
3. Ионы Mg2+ (необходимы для работы фермента),
4. Два праймера – одноцепочечныекороткие молекулы ДНК (длина чаще всегоот 18 до 24 нуклеотидов), комплементарные концам разных цепей обнаруживаемой последовательности ДНК.
5. Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов.
6. Термостойкую ДНК-полимеразу (чаще всего используется Taq-полимераза – полимераза, выделенная изThermus aquaticus).

Затем данная реакционная смесь помещается в амплификатор, который фактически представляет собой программируемый термостат. В амплификаторе проводится 30-40 циклов смены температур. Каждый из этих циклов состоит из трех этапов (см. Рис. 1):

1. Денатурация (температура 94оС) – разрываются водородные цепи, и цепочки ДНК расходятся.
2. Отжиг праймеров (температура обычно в районе 50-60оС) – к концам цепей ДНК присоединяются праймеры. Вообще, при снижении температуры энергетически выгоднее воссоединение исходных цепей ДНК из исследуемого образца (ренатурация), однако концентрация праймеров в реакционной смеси на много порядков больше концентрации ДНК из образца (по крайней мере, на начальных циклах ПЦР), поэтому реакция отжига праймеров протекает быстрее ренатурации ДНК. Температура отжига выбирается в зависимости от температур плавления (денатурации) праймеров.
3. Элонгация (температура обычно 72оС) – ДНК-полимераза достраивает праймеры по матрице длинных цепей ДНК. Температура соответствует оптимальной температуре работы используемой ДНК-полимеразы.

Детекция результатов отличается в различных вариантах постановки ПЦР и описана в разделе «Разновидности ПЦР».

 

Динамика ПЦР

На ранних циклах ПЦР количество двухцепочечных молекул ДНК, размер которых определяется расстоянием между местами посадки праймеров, удваивается с каждым циклом. Также образуется малое количество более длинных молекул ДНК, которым можно пренебречь (см. Рис 2).

Таким образом, на ранних циклах количество продукта ПЦР описывается формулой m*2n, гдеm– исходное количество искомой ДНК в пробе,n– число циклов. Затем реакция выходит на плато. Это происходит из-за накопления продукта реакции, снижения концентрации праймеров и дезоксинуклеотидтрифосфатов, а также за счет повышения концентрации пирофосфата (см. Рис 3).

 

 

2.Разновидности ПЦР

Конвенциональная ПЦР

В данном варианте постановки ПЦР реакция идет заранее выбранное число циклов (30-40), после чего анализируется, произошло ли накопление двуцепочечных молекул ДНК в реакционной смеси.

Данный вариант постановки ПЦР при использовании в качестве способа диагностики является качественным методом. Положительная реакция свидетельствует о наличии хотя бы следовых количеств искомых молекул ДНК в образце. Отрицательная реакция свидетельствует об их отсутствии. Количественная оценка содержания исходных молекул ДНК в образце невозможна из-за выхода реакции на плато.

Основным методом выявления наличия продукта является электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле. Продукты ПЦР разделяются в геле под действием электрического поля в соответствии с их молекулярной массой. В гель добавляется интеркалирующий краситель (флуоресцирующий в связанном с двухцепочечной ДНК состоянии - чаще всего бромистый этидий). Таким образом, при облучении ультрафиолетом можно будет увидеть наличие или отсутствие полоски, соответствующей ДНК необходимой молекулярной массы. При проведении ПЦР в диагностических целях всегда ставятся положительный и отрицательный контроли реакции, с которыми сравниваются образцы (см. Рис. 4).

ПЦР в реальном времени

В данном варианте постановки ПЦР количество продукта ПЦР в реакционной смеси регистрируется постоянно в ходе протекания реакции. Это позволяет построить кривую протекания реакции (см. Рис. 3) и, исходя из неё, рассчитать количество искомых молекул ДНК в образцах.

Один из видов проведения ПЦР в реальном времени – с использованием интеркалирующегокрасителя, который добавляется прямо в реакционную смесь (чаще всего используется SYBRGreen). Другой вид – с использованием одного из видов флуоресцирующих зондов, связывающихся с участком внутри ПЦР-продукта, что позволяет повысить специфичность обнаружения (см. Рис 5).Детекцияфлуоресценции происходит непосредственно в приборе в ходе протекания реакции.

Помимо возможности количественного обнаружения, существуют и другие достоинства ПЦР в реальном времени по сравнению с конвенциональной. Данный вариант ПЦР более прост, быстр, а также не требует открывания пробирок с продуктами ПЦР, что уменьшает вероятность загрязнения других образцов. Основной недостаток – более высокая стоимость амплификатора со встроенной возможностью детекциифлуоресценции по сравнению с обычным.

Цифровая количественная ПЦР

Новый, дорогостоящий и пока малораспространенный вариант ПЦР, позволяющий более точно определять количество ДНК в образце.В данном варианте реакционная смесь, содержащая флуоресцентный краситель, разбивается на огромное число микроскопических объемов (например, капелек в эмульсии). После протекания ПЦР анализируется, в какой доле капелек реакция оказалась положительной и, соответственно, наблюдается флуоресценция. Эта доля будет пропорциональна числу искомых молекул ДНК в образце.

ПЦР с обратной транскрипцией

В данном случае перед тем или иным вариантом ПЦР производится реакция обратной транскрипции (РНК в ДНК) с использованием фермента ревертазы. Таким образом, этот метод позволяет проводить качественное или количественное обнаружение молекул РНК. Это может использоваться для детекции РНК-содержащих вирусов или определения уровня транскрипции (количества мРНК) того или иного гена.

 

Рисунок 1.Этапы ПЦР. Красным цветом обозначены праймеры.

Рисунок 2.Накопление двуцепочечных молекул ДНК, ограниченных праймерами, в ходе ПЦР.

в                                                .

б                                               .

а                                               .

Рисунок 3.Динамика реакции ПЦР при разных изначальных концентрациях искомых молекул ДНК в пробе. 
(а) – наибольшая концентрация 
(б) – промежуточная концентрация 
(в) – наименьшая концентрация

K+     1   2   3   4   5   6   7   К-

Рисунок 4.Агарозный электрофорез продуктов ПЦР. К+ – положительный контроль (заведомо присутствует искомая ДНК).1-7 – исследуемые образцы (из них 1-2 – положительные, 3-7 – отрицательные).K- –отрицательный контроль (заведомо отсутствует искомая ДНК).Во многих случаях помимо целевого продукта видны более легкие неспецифические продукты реакции (праймер-димеры).

Рисунок 5. Способы детекции при использовании ПЦР в реальном времени. 
(а) – интеркалирующий краситель – флуоресцирует при связывании с двухцепочечной ДНК 
(б) – зонд Taqman – флуоресценция возникает при расщеплении зонда ДНК полимеразой с 5’-3’ эндонуклеазной активностью за счет разделения флуорофора и гасителя. 
(в) – зонд MolecularBeacon - флуоресценция возникает при гибридизации зонда с целевым фрагментом за счет пространственного отдаления флуорофора и гасителя 
(г) – зонды LightCycler - флуоресценция акцептора возникает при гибридизации зондов (содержащих акцептор и донор) с целевым фрагментом за счет резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).

3.Принципы ПЦР диагностики

ПЦР используется для амплификации определенного участка цепи ДНК (ДНК-мишень). Большинство методов ПЦР обычно амлифицируют фрагменты ДНК до ~ 10000 пар оснований (кб), хотя некоторые методы позволяют увеличивать фрагменты до 40 кб в размере. Реакция производит ограниченное количество конечного амплифицированного продукта, который регулируется имеющимися реактивами в реакции и обратной связью-ингибированием продуктов реакции.

Основной набор ПЦР требует нескольких компонентов и реактивов. Они включают:

• ДНК-матрицу, содержащую целевой участок ДНК, который требуется амплифицировать.
• Два праймера, комплементарные 3'-концам каждой из смысловой и антисмысловой цепей ДНК-мишени.
• Taq-полимераза или иная ДНК-полимераза, действующая при оптимальной температуре около 70 ° C.
• Дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ; трифосфатные группы, содержащие нуклеотиды), строительные блоки, из которых ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК.
• Буферный раствор, обеспечивающий подходящие химические условия для оптимальной активности и стабильности ДНК-полимеразы.
• Двухвалентные катионы, ионы магния или марганца; обычно используется Mg2 +, но также может использоваться и Mn2 + для ПЦР-опосредованного мутагенеза ДНК, так как более высокие концентрации Mn2 + увеличивают частоту ошибок в процессе синтеза ДНК.
• Одновалентные катионы ионов калия.

ПЦР обычно проводится в реакционном объеме 10-200 мкл в небольших реакционных пробирках (объемом 0.2-0.5 мл) в термоциклере-амплификаторе. Амплификатор нагревает и охлаждает реакционные пробирки для достижения температур, необходимых на каждом этапе реакции. Многие современные амплификаторы используют эффект Пельтье, который позволяет нагревать и охлаждать блок с ПЦР-пробирками просто путем изменения направления электрического тока. Тонкостенные реакционные пробирки способствуют благоприятной теплопроводности для обеспечения быстрого теплового равновесия. Старые амплификаторы, у которых отсутствует нагреваемая крышка, требуют слоя масла на поверхности реакционной смеси или шарика воска в пробирке.

4.Порядок процедуры

Как правило, ПЦР состоит из серий 20-40 повторяющихся изменений температуры, называемых циклами, причем каждый цикл обычно состоит 2-3 дискретных температурных этапов, обычно трех. Циклирование зачастую начинается и завершается одним температурным этапом (так называемым ожиданием) при высокой температуре (> 90 ° C) для окончательного расширения продукта или краткого хранения. Использующиеся температуры и длительность времени их применения в каждом цикле зависит от множества параметров. Они включают в себя фермент, используемый для синтеза ДНК, концентрацию двухвалентных ионов и дНТФ в реакции, и температуру плавления (Tm) праймеров.

• Этап инициализации: Этот этап состоит из нагрева реакции до температуры 94-96 ° C (или 98 ° C, если используются высоко термостабильные полимеразы), который проводится на 1-9 минут. Этап требуется только для ДНК-полимераз, которым необходима активация теплом, так называемым горячим стартом ПЦР.
• Этап денатурации: Является первым регулярным событием термоциклирования и состоит из нагревания реакции до 94-98°C в течение 20-30 секунд. Это вызывает расщепление ДНК-матрицы с разрушением водородных связей между комплементарными основаниями и образованием одноцепочечных молекул ДНК.
• Этап отжига: Температура реакции снижается до 50-65°С в течение 20-40 секунд, что позволяет праймерам связаться с одноцепочечной матрицей ДНК. Обычно температура отжига составляет около 3-5 градусов по Цельсию ниже Tm используемых праймеров. Стабильные водородные связи ДНК-ДНК формируются только, когда последовательность праймера точнее соответствует матрице последовательности. Полимераза связывается с гибридом «праймер-матрица» и начинает синтез ДНК.
• Этап расширения / элонгации: Температура на этом этапе зависит от используемой ДНК-полимеразы; Taq-полимераза имеет свою оптимальную температуру активности при 75-80°C; обычно используется температура 72°C для этого фермента. На этом этапе ДНК-полимераза синтезирует новую цепь ДНК, комплементарную цепи ДНК-матрицы, добавляя дНТФ, которые являются комплементарными матрице в направлении 5 'к 3', связывая 5'-фосфатную группу дНТФ с 3'-гидроксильной группой в конце образующейся (расширяющейся) ДНК. Время расширения зависит как от используемой ДНК-полимеразы, так и длины фрагмента ДНК, который необходимо амплифицировать. Как правило, при своей оптимальной температуре, ДНК-полимераза полимеризует тысячу оснований в минуту. При оптимальных условиях, т.е. при отсутствии ограничений вследствие ограничивающих субстратов или реактивов, на каждом этапе расширения, количество ДНК-мишени удваивается, что приводит к экспоненциальной (в геометрической прогрессии) амплификации фрагмента ДНК.
• Финальное удлинение: Это единственный этап, выполняющийся иногда при температуре 70-74°С в течение 5-15 минут после последнего цикла ПЦР для того, чтобы убедиться, что любые оставшиеся одноцепочечные ДНК удлинились полностью.
• Финальное ожидание: Этот этап при температуре 4-15 ° C в течение неопределенного времени может быть использован для кратковременного сохранения реакции. Чтобы проверить, синтезировала ли ПЦР ожидаемый фрагмент ДНК (также иногда называют «амплимер» или «ампликон»), применяется электрофорез в агарозном геле для разделения продуктов ПЦР по размеру. Размер ПЦР-продуктов определяется путем сравнения с лестницей ДНК (маркером молекулярного веса), которая содержит фрагменты ДНК известного размера, выполняется на геле наряду с ПЦР-продуктами.