Полусинтетические антибиотики

Полусинтетические антибиотики

 

Антибиотики широко используют в качестве молекулярных инструментов при исследовании фундаментальных проблем биологии, таких, как расшифровка тончайших механизмов биосинтеза белка, нуклеиновых кислот и структуры клеточных стенок бактерий, создание моделей транспорта ионов через биологические мембраны и др.

Изыскание новых антибиотиков обусловлено  как потребностями практики, так и накоплением резистентных форм микроорганизмов по отношению ко многим антибиотикам. Устойчивость бактерий к пенициллинам и цефалоспоринам создает присутствующий в их клетках энзим лактамаза (пенициллиназа). Фермент гидролизует амидную связь (β-лактамного цикла в молекуле антибиотика с образованием пенициллиновой кислоты, которая полностью лишена антимикробной активности:

 

Специальное изучение объема и потенциала защитных свойств микроорганизмов показало, что их резистентность к антибиотикам имеет глобальный характер и обеспечивается как разнообразием фенотипов резистентности, так и разнообразием и стабильностью систем горизонтального генного транспорта. Поэтому главное направление получения новых антибиотиков состоит не в открытии новых соединений, а в химической трансформации природных молекул для создания полусинтетических антибиотиков, характеризующихся значительно меньшей резистентностью и токсичностью, но более широким спектром действия, большим временем жизни, химической и биологической устойчивостью. Важный подход на пути получения устойчивых аналогов антибиотиков — использование природных ингибиторов β -лактамаз — клавулановой и оливановой кислот.

Методы получения антибиотиков путем химического синтеза чрезвычайно сложны и не могут конкурировать с их биосинтезом методами биотехнологии. Существует несколько способов получения как природных, так и полусинтетических антибиотиков.

1. Направленный биосинтез антибиотиков осуществляется путем прямой ферментации микроорганизма — продуцента с подходящим предшественником, что индуцирует синтез ферментов вторичного метаболизма в идиофазе. Точный механизм индуцирования первичными метаболитами генов, кодирующих синтез ферментов вторичного метаболизма, не расшифрован, однако выявлено, что молекулы предшественника необходимо добавлять в среду в период фазы роста микроорганизма. Установлено, что вводимый предшественник должен лимитировать скорость биосинтеза антибиотика. Например, производство бензилпенициллина в значительной степени стимулируется добавками его метаболического предшественника — фенилуксусной кислоты; пропионовая кислота и пропиловый спирт инициируют биосинтез макролидов через метилмалонил КоА; L-фенилаланин — предшественник фенилаланина — ускоряет образование грамицидина S. Аналогичный эффект вызывает использование ингибиторов метаболизма. Так, при подавлении процесса введения хлора микроорганизм S. аигеоfaciens образует тетрациклин, а не хлортетрациклин, а при ингибировании реакции метилирования им синтезируется деметилированное производное хлортетрациклина.
2. Другой способ получения антибиотиков состоит в использовании для их биосинтеза блокированных мутантов, у которых отсутствует (блокировано) определенное звено в цепи реакций, ведущих к синтезу антибиотика. Блокированные мутанты не способны образовывать нужный антибиотик. Используя низкую субстратную специфичность ферментов вторичного метаболизма и вводя аналоги предшественников антибиотика, последние переводят в аналоги самого антибиотика в ходе процесса, известного как мутационный биосинтез, или мутасинтез.

Так, мутанты Nocardia mediterranei, у которых нарушена способность к ацилированию, образуют аналог предшественника рифамицина В-рифамицин SV, который служит исходным веществом для получения многих синтетических рифамицинов (препараты для лечения туберкулеза и проказы).

 

Получение новых более эффективных аналогов пенициллина основано на изменении природы его ацильной группировки при сохранении в неизменном виде ядра пенициллина — 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК). В промышленности 6-АПК получают путем гидролиза природных пенициллинов с помощью специфического фермента — пенициллинацилазы, образующейся с высоким выходом в процессе ферментации ряда штаммов микроорганизмов. Ацилазы различают по их субстратной специфичности. Некоторые из ацилаз способны катализировать и обратные реакции — процессы ацилирования аминогруппы 6-АПК с образованием модифицированного пенициллина. Таким путем было получено более 40 000 полусинтетических пенициллинов. Существенно, что во многих случаях 6-АПК не выделяют из культуральной жидкости, например при превращении бензилпенициллина в ампициллин:

 

Бензилпенициллин гидролизуют  ацилазой мутанта Kluyvera citrophila при рН 7,8 — 8,0 и температуре 40—50⁰С. Затем в ферментер вносят мутант Pseudomonas melanogenum и фенилглицин. Условия ферментации изменяют таким образом (рН 5,0 — 5,5), чтобы ацилаза второго мутантного организма осуществляла синтез ампициллина:

 

 

 

Химиками были созданы нечувствительные к распространенным у стафилококков  пенициллиназам полусинтетические  пенициллины – метициллин, оксациллин, а также не чувствительный к ферменту синегнойной палочки карбенициллин. Это удалось после выделения из бензилпенициллина 6-аминопенициллиновой кислоты (6АПК), условно названной «ядром» молекулы пенициллина.

В промышленных условиях 6-АПК  производится путем ферментативного  гидролиза бензилпенициллина (в России) или феноксиметилпенициллина (за рубежом) с помощью фермента пенициллиназы, который осуществляет гидролиз пенициллина по связи СО-NH (между радикалом и ядром) с получением 6-АПК. На некоторых промышленных предприятиях (ОАО «Биохимик», г. Саранск), например, производят иммобилизованную пенициллиназу и на ее основе осуществляют многотоннажное производство 6-АПК.

Путем ацетилирования 6-АПК  и были получены: метициллин, оксациллин, карбенициллин.

В последние годы поиски природных и полусинтетических беталактамов, нечувствительных к беталактамазам, были продолжены. Эта работа также обусловлена тем, что у патогенных бактерий обнаружились беталактамазы со все более варьирующими свойствами. Некоторые из них воздействовали на оксациллин («оксациллиназы») и карбенециллин («карбенециллиназы»).

Обнаружено, что наличие метоксигруппы  или некоторых других заместителей в 6 α-положении у пенициллинов и  соответственно, в 7 α-положении у  цефалоспоринов приводит к тому, что  многие беталактамазы теряют способность гидролизовать беталактамное кольцо у таких природных или полусинтетических антибиотиков.

Кроме того, химические модификации  все чаще проводятся со структурой сконденсированного с беталактамом пятичленного или шестичленного  кольца. Если сера в пятичленном (пенициллины) или шестичленном (цефалоспорины) кольце замещена на кислород или углерод, то соединения получили названия «нетрадиционных» или «неклассических» беталактамов, в которых беталактамное кольцо сконденсировано с другим (т.е. 5 или 6- членным) кольцом. Они получили название «монобактамы», а наибольшую известность приобрел азтреонам. Природные монобактамы были выделены сравнительно недавно.

Относительная простота структуры  позволяет развернуть работы по химическому  синтезу монобактамов, нечувствительных к беталактамазам и быстро проникающих  в клетки. В настоящее время  в клинике применяются два  монобактама: цефтазидин и монолактам. Количество полусинтетических беталактамов сейчас составляет более десятка тысяч.

Целенаправленная трансформация  молекул аминогликозидов проводится с целью сделать их «нечувствительными» к инактивирующим ферментам. Наиболее перспективным является подход, реализованный на примере канамицина. В его молекуле конкретная функциональная группа была замещена остатком L – α-амино- α-оксимасляной кислоты. Полученное производное, названное «амикацин», оказалось высоко эффективным против штаммов бактерий, имеющих фосфотрансферазы, ацетилтрансферазы и аденилтрансферазы, инактивирущие исходный канамицин. В настоящее время наиболее эффективным полусинтетическим аминогликозидным антибиотиком является амикацин, т.к. он подавляет рост м/о резистентных к природным аминогликозидам за счет их ферментативной инактивации наиболее распространенного механизма резистентности микроорганизмов.

Антибиотиком группы макролидов класса азалидов является  сумамед (азитромицин), который синтезирован из молекулы эритромицина путем расширения лактонного кольца за счет введения азаметильной группы. Азагруппа  предотвращает разрушение препарата кислотой в желудке, что приводит к лучшей, чем у эритромицина, реабсорбции при приеме внутрь.

Новая химическая структура значительно  расширяет спектр действия препарата, изменяет фармакокинетические свойства азитромицина по отношению к другим макролидам, терапевтическая доза его в 10-15 раз меньше,  а курс лечения в 2-3 раза короче, чем у других макролидов.

Антибиотик, представляющий собой  комбинацию (1:2) сульбактама натрия и ампициллина натрия, известен под торговым названием «уназин» (сулациллин). Он имеет двойной механизм действия: сульбактам является ингибитором β – лактамаз и необратимо подавляет β – лактамазы. Сульбактам предотвращает разрушение ампициллина устойчивым синергизмом при введении с ним. Он также связывается с некоторыми пенициллинсвязывающими белками, что приводит к резкому росту антибактериальной активности ампициллина, в том числе и по отношению к штаммам, исходно чувствительным к нему. Комбинация этих препаратов используются только для парентерального введения.

Карбапенемы – это новое семейство β – лактамных антибиотиков, являющихся аналогами пенициллинов или клавамов  (β лактамных антибиотиков,  отличающихся от пенициллинов тем, что в тиазолидиновом кольце последних сера замещена на кислород – клавелловое оксазолидиновое кольцо) и в позиции 6 нет боковой цепи. Такой антибиотик – клавулановая кислота – выделен из Streptomyces clavuligerus, он слабо активен в отношении бактерий, но ингибирует стафилококковую  β – лактамазу  и  β – лактамазы, образуемые Гр «-» бактериями, в которых у первых – сера и у вторых – кислород замещены на углерод.

К этому семейству а/б относятся  оливановые кислоты и тиенамицин. Их продуцентами являются стрептомицины. Эти а/б обладают широким антимикробным спектром действия и являются выраженными ингибиторами β – лактамаз.

 

Особенности биосинтеза ампициллина.

В настоящее время полусинтетические  антибиотики (пенициллины) широко выпускаются  промышленностью. Ампициллин относится к аминопенициллинам, которые характеризуются широким спектром противомикробного действия, активны в отношении тех микробов, на которые действуют природные пенициллины, неактивны в отношении стафилококков, продуцирующих β-лактамазы, не действуют на синегнойную палочку. Ампициллин считается препаратом выбора при дизентерии. В клинике применяются и эфиры ампициллина (бакампициллин и пивампициллин), которые после всасывания в кишечнике деэтерифицируются и превращаются в ампициллин. Эти препараты всасываются в кишечнике значительно лучше, чем ампициллин и создают более высокие концентрации в крови после приема одинаковых доз.

Получение ампициллина и его  производных является классическим примером сочетания тонкого микробиологического  синтеза с органическим синтезом, позволившим сохранить основные преимущества бензилпенициллина (бактерицидность, низкий уровень токсичности) и добавить новые свойства (широта спектра действия).

Ампициллин получают путем ацилирования 6-АПК обычными методами, применяемыми в органической химии.

6-АПК она относительно слабо  растворима в воде и обычно  применяемых органических растворителях,  очень хорошо растворяются в  воде ее соли со щелочными  металлами.

В кислых и щелочных растворах 6-АПК  инактивируется (гидролизуется) подобно  бензилпенициллину, но в кислых растворах этот процесс протекает медленнее.

 

6-АПК получается в основном  двумя способами:

- путем ферментативного расщепления  бензилпенициллина при помощи  фермента пенициллиназы, образуемого  бактериями;

- либо путем ферментации с  подходящим штаммом пеницилла в среде без предшественника.

При получении 6-АПК вначале выращивают используемый м/о (например: клетки Nocardia, E. coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, нитчатые грибы и др.) в условиях, обеспечивающих его максимальную ферментативную активность, затем клетки отделяют на сепараторе или отмывают от балластных веществ и суспензируют в растворе пенициллина, в котором и происходит реакция образования 6-АПК. В ходе расщепления поддерживаются оптимальные условия: t, рН, зависящие от свойств м/о или вырабатываемого им фермента.

Расщепление длится несколько часов. После этого суспензию клеток фильтруют и прозрачный фильтрат обрабатывают с целью получения 6-АПК.

Это возможно несколькими способами:

1. Экстракцией в органический растворитель.

а) при помощи переносчика;

б) после переведения в шиффово  основание.

2. С помощью ионообменных смол.

а) анионитов;

б) катионитов.

3. Упариванием и кристаллизацией.

          1. Наиболее  простым методом получения кристаллической  6-АПК из раствора является  простое упаривание раствора (после удаления из него остаточного пенициллина путем экстракции бутилацетатом при рН=2,0) в вакууме до нужной концентрации и выделение 6-АПК путем установления нужного рН от 4,0 до 6,5. Упаривают при t=35 °С, лучше в циркуляционных или пленочных выпарных аппаратах. Выделившуюся 6-АПК отфильтровывают и промывают водой и ацетоном, высушивают.

         II.Полученную 6-АПК ацилируют в водном растворе в форме соли со щелочными металлами или с триэтиламином (в ацетоне при получении ампициллина). Ацилирующим агентом может быть хлорангидрид, бромангидрид или смешанный ангидрид производного D- (-) – α – фенилглицина и эфира хлоругольной кислоты (при получении ампициллина), которые вводят в реакционную смесь, предварительно растворенные в органическом растворителе, несмешивающемся с водой (ацетон, диоксан и т.п.).