Пути программируемой клеточной гибели

фекторная стадия. После восприятия апоптоти-ческого стимула клетка вступает в фазу комми-тации, во время которой она может нормально жить и функционировать, но ее гибель уже предопределена. Данная фаза может длиться часы и дни.

На первой стадии гибели проявляется коллапс ядра — пикноз ядра и клетки с потерей за несколько минут до 1/3 своего объема. Характерное проявление ядерной фазы — упорядоченная конденсация хроматина. Хроматин конденсируется по периферии, под мембраной ядра в виде полулуний (рис. 1 А; 1-Иа). Иерархическая структура хроматина отражается в поэтапности процесса фрагментации: формирование крупных фрагментов в 300 тыс. п.о., затем фрагментов в 30-50 тыс. п.о. и более глубокая апоп-тотическая деградация генома связаны с формированием олигонуклеосомных ДНК — 180 п.о. (рис. 1 Б). Этот тип деградации обеспечивается активацией Са²⁺, 1У^²⁺'зависимыми эндонукле- 

азами, которые специфично вносят разрывы в 
области 5' TGA TGCT 3' ДНК. Эффекты кон 
денсации и деградации хроматина являются тка- 
неспецифичными.

Финальная фаза апоптоза протекает в цитоплазме от 15 мин — 1 ч в два этапа — блеббинг (blebbing) и формирование «апоптотических тел». Ранее считалось, что увеличение объема органелл является признаком, характерным для некроза, однако и при апоптозе происходят существенное набухание митохондрий, вплоть до разрыва внешней митохондриальной мембраны, набухание лизосом. В плазматической мембране нарушается асимметрия фосфолипидов с экспозицией фосфатидилсерина и нуклеосом на внешней мембране клетки, что способствует узнаванию и фагоцитозу макрофагами апоптичес-ких клеток (J.Z. Parrish, 2006). Происходят потеря и реорганизация контакта с внеклеточным матриксом, демонтаж микротрубочек, это определяет округленную морфологию клетки и потерю контактов с другими клетками.

Период продолжительного «кипения» / «пу-зырения» плазматической мембраны — это период формирования блеббов (рис. 2). Кульминация — формирование апоптозных тел и их фагоцитоз. В апоптозных телах могут быть фрагменты ядер, элементы аппарата Гольджи, митохондрий и т.д. При этом клеточное содержимое не попадает в межклеточное пространство и

 

 

 

 

 

не вызывает воспалительной реакции. Апопти-ческий путь гибели клетки обеспечивает минимальное повреждение тканей по сравнению с другими механизмами смерти. В ходе реализации программы апоптоза происходит подавление ферментов, активность которых может приводить к запуску некроза.

Морфологические признаки ПН (рис. 3) — набухание клеток и  мембранных органелл, неспецифическая компактизация и неупорядоченная фрагментация хроматина, вакуолизация цитоплазмы, нарушение целостности плазматической мембраны и выход содержимого клеток, а также ферментов/маркеров деструкции во внеклеточное пространство. При этом происходят характерные изменения в первую очередь в цитоплазме в отличие от апоптоза. В цитоплазме происходят денатурация и коагуляция белков, мембранные структуры распадаются, нарушаются окислительно-восстановительные процессы и синтез АТФ в митохондриях, и вся клетка начинает страдать от нехватки энергии. Ядро сморщивается вследствие конденсации хроматина (кариопикноз), затем оно распадается на глыбки (кариорексис) и растворяется (кариоли-зис).

Морфологическими проявлениями ПКГ по пути MCD — отсутствие сегрегации хромосом, конденсация и фрагментация хроматина носит механический   и   неупорядоченный   характер, 

клетка блокируется в одной  из фаз митоза, нарушены организация веретена и выстраивание хромосом в виде метафазной пластинки и последующие деструктивные события по типу апопто-тических. Проявляются многополюсные митозы.

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПУТЕЙ ПКГ ГЕНЫ ПКГ

Молекулярные механизмы  метаболических путей, гены аутофаголизиса являются эволю-ционно консервативными. Открыты семьи генов (от дрожжей до человека), вовлеченные в формирование аутофагосом. Гены ATG (Atg7 и Beclinl) играют ключевую роль в формировании аутофагосом, в обеспечении выживаемости клеток при голодании или отсутствии факторов роста (Y.P. Yang, 2005).

Ген BNIP3, вызывающий некротическую и апоптическую форму гибели клетки, определяет раннюю проницаемость плазматической мембраны, вакуолизацию цитоплазмы и аутофагию митохондрий. В реализации программы ПН участвуют гены, кодирующие белки, вовлеченные в регуляцию клеточного кальциевого гомеостаза, так же, как гены кальпаиновых протеаз.

Генетический контроль и реализация апоптоза у С. elegans детерминируются генами и семейством каспаз — ced-3, ced-4, ced-9, ces-1, ces-2, egl-1, nuc-1. Продукт ced-3 идентифицирован какцистеиноваяпротеаза. Его гомологи (правда, с активностью сериновых протеаз) обнаружены у млекопитающих, которые образуют семейс-

 

тво каспаз. Интересно, что  некоторые из генов, контролирующих апоптозную реакцию у людей, являются очень древними. Например, ген Вс1-2 имеет структурное сходство с геном Ced-9, и являются взаимозаменяемыми. Избыточная экспрессия Вах стимулирует апоптотическую программу, но коэкспрессия Bcl-XL переключает ее на некротическую. В целом проапоптотические и антиапоптотические члены Bcl-2-семейства, в равной мере реализуются в апоптотической и некрозпрограммируемой форме деструкции клеток.

БИОХИМИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

В процессе реализации различных  программ клеточной гибели активируются специфические ферменты и белки. Тем не менее наблюдается сходство в биохимических механизмах реализации путей ПКГ.

Апоптоз включает в себя активацию специфических цистеиновых протеаз (каспазы) и обусловленную ими деградацию белков в клетке. У млекопитающих охарактеризовано 14 каспаз, которые разделены на два подсемейства: CED3 (непосредственно участвуют в ПКГ «эффектор-ных каспаз» или каспазы второго эшелона) и ICE (обеспечивают процессинг провоспалительных цитокинов). Это каспазы первого эшелона, обеспечивающие восприятие апоптотических сигналов и передачу их на систему «эффекторных каспаз», которые непосредственно гидролизируют структурные белки клетки. Известно также, что каспазы могут проявлять и антиапоптическое действие. Вообще у эукариот охарактеризовано всего 48 цистеиновых протеаз семейства каспаз: одна у дрожжей, три у нематод, семь у насекомых, восемь у земноводных, четыре у рыб, четыре у птиц, десять у мышей и 14 у человека.

Каспазы, активируя друг друга в каскаде, накапливаются в клетке и поражают свои многочисленные мишени (ламинин вызывает сморщивание ядра; G-актин, ферменты репарации ДНК и регуляторы клеточного цикла), специфически распознают последовательность, состоящую из аминокислотных остатков, обозначаемых Р4-РЗ-Р2-Р1 (наиболее консервативным остат- 

ком являются аспарагиновая кислота  в позиции Р1 и остаток глутамина  в позиции РЗ). Так, кас-паза-9 является общим инициатором внутреннего пути запуска ПКГ, каспаза-3 контролирует фрагментацию ДНК и участвует совместно с кас-пазой-7 в потере клеточной жизнеспособности, обе они являются ключевыми медиаторами нарушения митохондриального мембранного потенциала, высвобождения AIF. Расщепление цитоскелетных белков каспазой-3 ведет к реорганизации цитозоля и блеббингу.

Важный компонент индукции апоптоза во многих типах клеток — свободный цитоплаз-матический Са²⁺, который высвобождается из внутриклеточных депо (ЭПР, аппарат Гольджи, митохондрии). В индукции апоптоза важная роль принадлежит белку р53. На ранних стадиях повреждения ДНК повышается его экспрессия, вызывая блок клеточного цикла в фазе G_x и G₂ до репликации ДНК и митоза, обеспечивая возможность репарации поврежденной ДНК и предотвращая тем самым появление мутантных клеток.

Так, при ПН в большей  мере активируются лизосомальные кальций-зависимые протеазы: кальпаин, катепсин, протеасомы в меньшей мере каспазы. Как и при апоптозе, в некротической гибели задействован механизм белковой деградации. При этом кальпаин и катепсин играют ключевую роль в «демонтаже» клеток. Активация ферментов определяется увеличением, выше критического уровня, содержания в цитоплазме ионов Са²⁺ и ставят под угрозу целостность мембраны лизосом, определяя, таким образом, развитие процесса, напоминающего аутофагию.

При аутофагии экспрессируются специфические белки, в первую очередь Atg, Apg, Aut, Cvt, трипсин, кальпаин, каспаза-3, катепсин, увеличивается содержание цитоплазматического Са²⁺ (Т. Yorimitsu, 2006). В ЭПР за счет Atg-белков происходит формирование преаутофагосом. Тем не менее факторы, позволяющие регулировать индивидуальное выживание клетки при аутофагии, пока до конца не изучены.

Ингибирование каспаз усиливает  каспаза-не-зависимые апоптоз-подобную ПКГ, аутофагию

 

или ПН. Известны две изоформы Hsp, которые обуславливают толерантность клеток к экстремальным условиям и проведение апоптотичес-кого сигнала. При истощении запасов белка HSP-70 ПКГ развивается по каспазо-независи-мому пути с ингибированием инициации ауто-фагии (G. Kroemer, 2005).

РОЛЬ ОРГАНЕЛЛ В ИНИЦИАЦИИ ПУТЕЙ ПКГ И ПУТИ АПОПТОЗ-НЕКРОЗНОГО КОНТИНИУМА МИТОХОНДРИИ

Первый путь апонекроза с участием митохондрий ведет к аутофагии, без активации каспаз (митапоптоз). Второй осуществляется за счет высвобождения AIF. Митохондриальный путь запуска ПКГ активируется тепловым шоком, при этом снижается мембранный потенциал митохондрий, за счет образования мегакана-лов увеличивается продукция АФК комплексом III дыхательной цепи, происходит разобщение окислительного фосфорилирования, увеличивается содержания Са²⁺ в цитоплазме. Следствием раскрытия пор являются набухание митохон-дриального матрикса, разрыв наружной мембраны митохондрий и высвобождение ряда апоптогенных факторов: цитохром с, прокаспа-зы 2, 3 и 9, AIF, ионы Са²⁺. Основа этого феномена — нарушение проницаемости ионотроф-ных рецепторов, регулирующих содержание К⁺, Na⁺, Cl~ и Са²⁺ с активацией протеаз, при этом активируется ПОЛ, с последующим развитием окислительного стресса, вызывая как некрозп-рограммируемую, так и апоптическую гибель клеток (D.Bano, 2005). Изменение уровня АТФ может определять направление гибели клетки по апоптотическому или некрозпрограммируе-мому пути, причем решающим может являться даже не абсолютное количество АТФ, а отношение АТФ/АДФ в клетке. Са²⁺-регулируемые процессы также вовлекаются в передачу сигналов для удаления апоптических клеток и клеточного дебриса с помощью тканевых фагоцитов. Истощение запасов АТФ определяет переключение с программы апоптоза на программу. Цитохром с 

и APAF-1 участвует в активации каспазы-9 (рис. 4), образуется конструкция апоптосомы. Затем прокаспаза-9 связывает прокаспазу-3, и они взаимоактивируются.

ЭПР И АППАРАТ ГОЛЬДЖИ

Существует  путь передачи сигнала ПКГ с участием ЭПР — параптоз, без признаков уплотнения хроматина ядра, но с признаками эндоплазмати-ческой вакуолизации (V.L.Johnson, 2000). В ЭПР локализована прокаспаза-12, поступая в цитоплазму, активируется, реализуя ЭПР-зависимый апоптоз. Прокаспаза-12 способна к автоактивации или активируется с помощью кальпаинов и каспазы-7. Этот путь запуска апаптоза связан с болезнью Альцгеймера

При Гольджи-специфическом  стрессе происходит увеличение церамидов, нарушение мембранного трафика с выбросом белков субстратов каспаз (T.Yorimitsu, 2006). Во время апоптичес-кой разборки комплекса Гольджи стопки дикти-осом теряют свое перинуклеарное положение и распадаются на везикулы и тубулярные кластеры, сходные с митотической разборкой. В комплексе Гольджи и ядре локализуется прокаспа-за-2, играющая центральную роль в передаче апоптических сигналов.

РЕЦЕПТОРЫ

Ключевыми участниками  ПКГ являются рецепторы смерти (death receptors — DR). Наиболее изученными рецепторами смерти являются: CD95 (он же Apol и Fas), рецептор фактора некроза опухолей-1 — TNFR1 (он же р55), DR3 (он же АроЗ, WSL-1, TRAMP и LARD), DR — 5 (DR5, он же Аро2 и KILLER), DR 4 и 6 (DR4 и 6). Рецептор семейства Fas (CD95) и TNF-рецепторов индуцируют апоптическую и некроз-подобную ПКГ (M.Leist, 2001).

Так, например, взаимодействие Fas с Fas-L (ли-ганд) приводит к апоптозу клетки. При связывании лиганда с рецептором происходит олигоме-ризация цитоплазматических белков: DD (death domain — домен смерти), относящийся к рецептору, адапторного белка — FADD (Fas-ассоции-

 

рованный домен смерти), содержащий DED — эффекторный домен смерти (death-effector domain) и прокаспазы-8 с образованием CARD (caspase activation and recruitment domain — домен активации и рекрутирования каспазы) (рис. 5). В результате этого формируется апоп-тосома (сигнальные комплексы, индуцирующие смерть — DISC — death-inducing signaling complex) — агрегаты, в которых происходит активация каспаз сначала первого, затем второго эшелона. Мутации в гене fas или в гене fas-L приводят к развитию аутоиммунных заболеваний.

МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ КОНТАКТЫ

Взаимодействие клеток с внеклеточным мат-риксом осуществляется с помощью интегринов, которые участвуют в адгезии клеток, связывая внутриклеточный цитоскелет с внеклеточным матриксом. Нарушение адгезии клеток индуцирует особый путь апоптоза — анойкис.

ЛЕЙКОЦИТЫ И АПОПТОЗ

Цитотоксические Т-лимфоциты  киллеры могут вызывать апоптоз у инфицированных клеток с помощью белка перфорина и гранзима. Поли-меризуясь, перфорин образует в цитоплазма-тической мембране клетки-мишени трансмембранные каналы, по которым внутрь клетки 

поступают гранзимы (фрагментины) —  смесь сериновых протеаз. Существенным компонентом этой смеси является гранзим В — протеоли-тический фермент, превращающий прокаспазу-3 в активную каспазу-3 с дальнейшей реализацией апоптоза.

АПОПТОЗ ЭРИТРОЦИТОВ

Особую форму апоптоза претерпевают эритроциты млекопитающих. Биогенез эритроцитов из плюропотентной стволовой клетки в костном мозге включает ряд промежуточных этапов. На этапе эритробласта ядро изгоняется (выталкивается) из клетки и пожирается макрофагом. Альтернативный вариант — кариорексис с образованием телец Жолли и их последующий распад и лизис внутри клетки. Безъядерная клетка, называемая ретикулоцитом, в дальнейшем теряет митохондрии и рибосомы и превращается в эритроцит. Потерю ядра эритробластом можно рассматривать как особую форму ядерного апоптоза. Лишенный ядра и митохондрий эрит- роцит, исполнив свое назначение, по-видимому, включает программу гибели, чтобы после этого поступить в распоряжение макрофагов печени и селезенки с выраженными признаками по пути апоптоза, который реализуется без участия кас-паз.

Таким образом, ПКГ вовлечена  в разнообразные биологические события, которые включают морфогенез, тканевой гомеостаз, и устранения дефектных клеток на протяжении всего онтогенетического развития многоклеточного организма. Обнаружено, что возникновение многих тяжелых заболеваний связано с нарушениями различных программ клеточной гибели (P.Codogno, 2005; M.Artal-Sanz, 2005; A.Kelekar 2006; T.Yorimitsu, 2006). ПКГ может определяться типом и уровнем дифференцировки, положением в клеточном цикле, набором присутствующих в микроокружении цитокинов, состоянием энергетической системы. Апоптическая, ауто-фагическая и некроз-программируемая гибель клеток имеет общие молекулярные механизмы, несмотря на некоторые особенности, биохимические и морфологические характеристики их перекрываются, отражая наличие в клетках широкого спектра танатогенных подпрограмм деструкции (СЯ.Проскуряков, 2002; P.Codogno, 2005).