Регуляция транскрипции у про- и эукариот

ЛЕКЦИЯ

РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ У ПРО- И ЭУКАРИОТ

Экспрессия генов как  у прокариот, так и у эукарит  регулируется при помощи целого ряда механизмов. Некоторые из механизмов такого рода, действующие в бактериальных  системах, изучены довольно хорошо, но о том, как действуют регуляторные механизмы в клетках эукариот известно немного.

Осуществляя контроль за тем, каким генам экспрессироваться, а каким нет, а также регулируя  уровень экспрессии различных генов, клетки приспосабливают свой фенотип  к определенным условиям внешней и внутренней среды. Часто гены экспрессируются последовательно: активация одного гена вызывает экспрессию другого или нескольких генов, приводя, в конечном счете, к каскаду событий. Некоторые гены или родственные группы генов экспрессируются координировано, т.е. отвечают на регуляторный сигнал одновременно и, как правило, в одинаковой степени. Вероятно, наиболее совершенные регуляторные системы – те, которые позволяют плюрипотентным стволовым клеткам (митотически активные клетки, в результате деления которых происходит замещение погибших клеток в многоклеточном организме) дифференцироваться с образованием клеток разного типа в процессе развития сложного организма.

Фенотипические признаки клеток разных типов, а также одной  и той же клетки в различных условиях зависят от количества и свойств продуцируемых ими структурных, каталитических и регуляторных белков. Регулироваться может какой-то один или несколько отдельных этапов считывания генетической информации при синтезе белка.

Прокариоты

Прокариоты – это простейшие одноклеточные организмы, которым для того, чтобы выжить, требуется лишь благоприятная химическая среда.

Некоторые необходимые  понятия.

Репрессор – это белок, блокирующий транскрипцию гена. В lac-системе репрессор представляет собой тетрамерный белок, и называется lac-репрессором. Он связывается с определенным участком на ДНК, который называется оператором.

Оператор (О) представляет собой небольшой участок ДНК, граничащий с первым структурным  геном. Белок-репрессор может связываться  с этим участком, блокируя тем самым инициацию транскрипции. Операторная последовательность, с которой связывается репрессор, содержит участок палиндромной ДНК. Последовательность с ось симметрии второго порядка (прозрачка 1), является частью места связывания с репрессором в lac-опрероне.

Промотор (Р) – это  небольшой участок ДНК перед  оператором. Он служит местом связывания РНК-полимеразы. Место связывания репрессора (О) и участок Р слегка перекрываются, так что, когда репрессор находится  на ДНК, РНК-полимераза не может связаться с промотором и транскрипция не идет.

Индуктор представляет собой низкомолекулярное вещество, который связывается с репрессором  и переводит его в неактивную форму, неспособную более связываться  с оператором. Так, в lac-системе индуктором является лактоза, после ассоциации с которой, репрессор отсоединяется от lac-оператора. Индукция является одной из форм негативной регуляции, называется так потому, что транскрипция может идти лишь после удаления репрессора. Еще одной разновидностью негативной регуляции является так называемая катаболитная репрессия.

Репрессия происходит тогда, когда репрессор связывается  с оператором не иначе как в  комплексе с низкомолекулярным  кофактором (корепрессором). Таким корепрессором  часто бывает конечный продукт белкового синтеза, кодируемый опероном. Тогда, если концентрация этого продукта становится слишком высокой, он связывается с репрессором, и дальнейший его синтез прекращается. Примером такой системы может служить триптофановый оперон.

Регуляция содержания РНК в процессе биосинтеза

Регуляция образования  РНК осуществляется на уровне инициации  транскрипции:

1. за счет модификации структуры РНК-полимеразы. Так, β-субъединица РНК-полимеразы E.coli изменяется при заражении клеток некоторыми бактериофагами, а при споруляции определенных штаммов Bacillus наблюдается образование новой σ-субъединицы. В обоих случаях изменяется способность РНК-полимеразы к связыванию с промотором и скорость транскрипции соответствующих генов.
2. Заключается в изменении пространственной структуры ДНК, что влияет на способность РНК-полимеразы связываться с определенными промоторами и инициировать синтез РНК.
3. Ингибирование или стимулирование взаимодействия РНК-полимеразы с некоторыми промоторами при участии белков, которые связываются с ДНК в месте присоединения полимеразы или вблизи него. На связывание таких регуляторных белков – репрессоров и активаторов – часто влияют определенные метаболиты, играющие роль корепрессоров и коактиваторов.

Предположение об индукции синтеза ферментов было высказано Жакобом и Мано в 1961 г., для того, чтобы объяснить, каким образом бактериальные клетки реагируют на изменения окружающей их среды. Если для обеспечения жизнедеятельности клетки необходим какой-то метаболит, она должна быть способна к синтезу ферментов, которые «пристроят» его в нужное место. Однако синтезировать такие ферменты в отсутствии соответствующего метаболита было бы для клетки расточительством.

Согласованная регуляция экспрессии прокариотических генов

Согласованная регуляция  групп родственных генов. У Е. coli гены, кодирующие белки одного и того же метаболического пути или определяющие близкородственные функции, часто регулируются согласованно. Это значит, что их экспрессия начинается и заканчивается или согласованно продолжается в ответ на один и тот же регуляторный сигнал. Гены, подчиняющиеся согласованной регуляции, в геноме часто бывают сцеплены и транскрибируются с промотора, находящегося на 5'-конце такой группы генов (кластера), в виде единственной молекулы РНК, называемой полицистронным (или полигенным) транскриптом. Группа координированно экспрессирующихся генов называется опероном.

Гены, кодирующие несколько  родственных функций, не всегда образуют единый оперон. Так, гены, кодирующие 30S- и 50S-рибосомные белки, организованы во множественные оперoны, в чей состав иногда входят гены, кодирующие другие белки, которые участвуют в транскрипции и/или трансляции. Как правило, отдельные опероны, кодирующие родственные функции, имеют одинаковые или сходные регуляторные последовательности и поэтому реагируют на определенный регуляторный сигнал сходным образом.

Позитивная и негативная регуляция

- Негативная регуляция  инициации транскрипции, или репрессия,  осуществляется белками-репрессорами, которые связываются с операторами.  Поскольку последовательности оператора и промотора часто перекрываются, связывание репрессоров со своими операторами ограничивает доступ РНК-полимеразы к промотору, подавляя тем самым инициацию транскрипции.

• Позитивная регуляция может осуществляться путем связывания специфических белков с нуклеотидными последовательностями, расположенными в области промотора. Считается, что связанный активаторный белок способствует ассоциации РНК-полимеразы с промотором и, следовательно, увеличивает вероятность инициации транскрипции.

а) Регуляция экспрессии галактозного оперона

Три гена, кодирующие ферменты, ответственные за метаболизм галактозы  у E.coli, организованы в оперон с промотором (Р) и примыкающим к нему регуляторным сегментом-оператором (О) на 5'-конце транскрибируемой последовательности: galE-galT-galK. (прозрачка 4).

Гены, кодирующие регуляторные белки, которые связываются с  операторными или активаторными  последовательностями, могут находиться как вблизи контролируемых ими генов, так и далеко от них. Например, ген, кодирующий репрессор галактозного оперона (gaIR), не сцеплен с транскрипционной единицей, состоящей из генов galE, gal Т и gal К (прозрачка 4).

б) Регуляция экспрессии арабинозного оперона

Синтез ферментов, необходимых  для утилизации арабинозы, регулируется двумя сопряженными транскрипционными единицами (прозрачка 4а). Первая – это ara -оперон, состоящий из трех генов, ara В, ara А и ara D, и некоего 5'-контролирующего участка. Вторая представлена геном ara С, кодирующим регуляторный белок, необходимый для транскрипции ara –оперона.

Позитивная или негативная регуляция транскрипции арабинозного оперона зависит от того, образуется или нет комплекс между арабинозой и белком, кодируемым только сцепленным с опероном геном araC (прозрачка 4а) J

в) Регуляция экспрессии лактозното оперона

Рассмотрим позитивную и негативную регуляцию лактозного оперона

- Негативная регуляция лактозного  оперона. Бактерии Е. coli могут использовать в качестве единственного источника углерода и энергии лактозу, поскольку они способны образовывать в большом количестве β-галактозидазу- фермент, расщепляющий лактозу на глюкозу и галактозу. Однако при росте на других источниках углерода в клетках E.coli образуется очень мало β -галактозидазы. Ген, ответственный за синтез β -галактозидазы (lac Z), называется индуцибельным, поскольку кодируемый им фермент синтезируется только тогда, когда в клетке присутствуют сахара, имеющие β -галактозильные остатки. Помимо β -галактозидазы, β -галактозиды индуцируют образование еще двух белков: (β -галактозидпермеазы (кодируемой геном lacY), необходимой для проникновения β-галактозидов в клетку, и β -галактозидтрансацетилазы (lac А), фермента с невыясненной пока функцией (прозрачка 5). В этих трех генах- lac Z, lacY и lac А- содержится вся информация о белках, кодируемых lac-опероном. Они транскрибируются в единую полицистронную РНК, при трансляции которой образуются почти одинаковые количества соответствующих белков. Поэтому можно сказать, что три гена lас-оперона экспрессируются согласованно.

Со структурными генами lac-оперона связаны несколько типов регуляторных элементов, ответственных за индуцибельность и координированную регуляцию этих генов (прозрачка 5). Промотор – это нуклеотидная последовательность, с которой связывается РНК-полимераза и начинается транскрипция трех структурных генов. Оператор – это сайт, с которым связывается lac-репрессор, подавляющий транскрипцию lас-оперона. Ген 1асI, не входящий в состав lас-оперона, кодирует репрессор – полипептидную цепь с мол. массой 37 000 Да. Репрессор прочно связывается с оператором, находясь в тетрамерной форме.

Поскольку промоторная и операторная  последовательности перекрываются, связывание репрессора с оператором мешает связыванию РНК-полимеразы с промотором, что  приводит к блокированию транскрипции структурных генов. Транскрипцию оперона можно индуцировать, если блокировать связывание репрессора с оператором (прозрачка 6). Такое блокирование происходит при связывании одного из β -галактозидов с той или иной субъединицей репрессора, что уменьшает сродство последнего к оператору. После отсоединения репрессора от промотра полимераза может связаться с промотором и инициировать транскрипцию оперона.

Очень важно сохранение нуклеотидной последовательности домена lас-оператора, связывающего репрессор. Об этом свидетельствуют результаты исследования эффективности репрессии in vivo у мутантов с модифицированными репрессорами или операторами (прозрачка 7). Интересные данные были получены и при изучении связывания очищенных репрессорных белков с операторами дикого типа и мутантными формами in vivo. Мутации, уменьшающие сродство репрессора к оператору, приводили к конститутивному синтезу ферментов, кодируемых lac-опероном, т. е. к экспрессии lас-ферментов в отсутствие индуктора. Мутации, сопровождающиеся накоплением репрессора в клетках или увеличением сродства репрессора к оператору, делали lас-оперон неиндуцибельным.

• Позитивная регуляция лактозного оперона. Для экспрессии lас-оперона, как и других индуцибельных оперонов, которые осуществляют контроль синтеза ферментов, участвующих в метаболизме cахаров, необходимо не только снять репрессию оперона, но и получить некий сигнал; Таким сигналом служит комплекс циклического АМР (сАМР) с белком-активатором катаболизма (CAP, от англ. catabolite activator protein), который связывается со специфической последовательностью, находящейся в самом начале lac-промотора (прозрачка 8).
• сАМР, принимающий участие во многих клеточных процессах, образуется из АТР (прозрачка 8а) в ответ на самые разные вне - и внутриклеточные события.
• САР представляет собой димер из идентичных полипептидных цепей с мол. массой 22 кДа.

Связывание комплекса  САР-сАМР со специфической последовательностью  в начале промотора приводит к  усилению транскрипции lac-оперона почти в 50 раз. Сам по себе CAP не способен к такому связыванию и стимуляции транскрипции. Усиление транскрипции с помощью комплекса САР-сАМР можно объяснить:

1. связываясь с ДНК в непосредственной близости от сайта присоединения РНК-полимеразы, он усиливает сродство этого фермента к промотору (прозрачка 9).
2. Альтернативная гипотеза заключается в том, что связывание САР-сАМР с САР-сайтом предотвращает присоединение РНК-полимеразы к расположенному поблизости слабому промотору и увеличивает тем самым вероятность того, что полимераза свяжется с «правильным» промоторным сайтом. Высказывавшееся ранее предположение, что комплекс САР-сАМР изменяет топологию ДНК, так что облегчаются связывание полимеразы и транскрипция, кажется несостоятельным.

Комплекс САР-сАМР является положительным сигналом при регуляции экспрессии и других оперонов, в частности тех, которые кодируют ферменты расщепления углеводов (галактозный и арабинозный оперон) а также работу оперонов, кодирующих ферменты, которые участвуют в деградации аминокислот, пуринов и пиримидинов.