Репликация ДНК

1. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК.

Репликацией называется процесс удвоения ДНК. Принципиальный механизм репликации вытекает из строения молекулы ДНК. Для того, чтобы объяснить, каким образом может самокопироваться (редуплицироваться), такая стабильная и замкнутая на себя структура, как двойная спираль ДНК, Уотсон и Крик предположили, что ее цепи способны к раскручиванию и последующему частичному разделению вследствие разрыва водородных связей в каждой комплементарной паре оснований. Образовавшиеся одноцепочечные участки родительской молекулы могут служить матрицей, к которой по принципу комплементарности оснований присоединяются соответствующие нуклеотиды. Эти нуклеотиды соединяются между собой фосфодиэфирными связями с образованием новой цепи, комплементарной родительской. Так как этот процесс происходит на каждой разделившейся цепи исходной молекулы, то в результате образуются две двухцепочечные структуры, идентичные родительской ДНК. Такой способ репликации получил название полуконсервативного, поскольку в каждой из вновь образовавшихся молекул одна цепь является старой (родительской), а другая – вновь синтезированной (дочерней). Этот механизм обеспечивает возможность такого распределения ДНК между делящимися клетками, при котором каждая дочерняя клетка получает гибридную двухцепочечную молекулу ДНК, состоящую из родительской и вновь синтезированной цепей.

Независимо от того, содержит клетка только одну хромосому (как у прокариот) или много хромосом (как у эукариот) за период времени, соответствующий  одному клеточному делению, весь геном должен быть реплицирован только один раз. Репликация происходит в S-фазу клеточного цикла и влечет за собой деление прокариотической или эукариотической клетки. Процесс репликации состоит из трех стадий: инициации (начало процесса), элонгации (собственно синтез) и терминации (окончание процесса).

Единица, с помощью которой клетка контролирует отдельные акты репликации, получила название репликона. Каждый репликон в каждом клеточном цикле активизируется только один раз. В нем обязательно должны присутствовать необходимые для репликации контролирующие элементы: точка начала (origin), в которой инициируется репликация, точка окончания (terminus), в которой репликация останавливается.

В точке начала репликации начинается разъединение цепей ДНК, формируется репликационный «глазок». Точка, в которой происходит репликация, получила название репликационной вилки (см. Приложение). Репликация может осуществляться либо в одном, либо в двух направлениях. При однонаправленной репликации вдоль ДНК движется одна репликационная вилка. При двунаправленной репликации от точки начала в противоположных направлениях расходятся две репликационные вилки. Бактериальный геном представлен одним репликоном (см. Приложение). Каждая хромосома эукариот образована большим колическтвом репликонов, соответственно имеется много точек начала репликации. Это значительно сокращает продолжительность процесса. По мере прохождения репликации «глазки» постепенно расширяются и сливаются друг с другом (см. Приложение).

Процесс репликации осуществляется сложным ферментным комплексом, насчитывающим 15-20 различных белков (Условия репликации см. Приложение).

Инициация. Точки начала репликации на молекуле ДНК имеют специфическую последовательность оснований, богатую парами А-Т. Процесс начинается с того, что с каждой такой последовательностью связываются несколько молекул специальных узнающих белков (у прокариот это белки DnaA).

Первым начинает действовать фермент геликаза (от helix - спираль). Он обеспечивет расплетение двойной спирали родительской ДНК путем разрыва водородных связей между нуклеотидами. На это затрачивается энергия гидролиза АТФ – по две молекулы на разделение 1 пары нуклеотидов. У эукариот одновременно происходит вытеснение данного участка ДНК из связи с гистонами и другими хромосомными белками.

Однако расплетение спирали  на некотором участке создает суперспирализацию перед этим участком, так как каждая молекула ДНК некоторыми участками зафиксирована на ядерном матриксе. Поэтому она не может свободно вращаться при какого-то своего участка. Это и вызывает суперспирализацию, что препчтствует дальнейшему расплетению цепи.

Эта проблема решается с помощью  ферментов топоизомераз. Существует два типа топоизомераз (топоизомераза типа I и топоизомераза типа II). Топоизомераза I разрывает одну из цепей ДНК, и переносит один свободный конец на себя. Это позволяет участку ДНК от места расплетения до места разрыва вращаться вокруг целой цепи, что предупреждает образование супервитков. Впоследствии концы разорванной цепи вновь замыкаются. Топоизомераза II разрывает обе цепи ДНК, перенося соответствующие концы на себя. Это позволяет более эффективно решать проблему суперспирализации при расплетении ДНК.

После расплетения двойной спирали  хеликазой, с каждой из двух нитей  связываются специальные SSB-белки. Они обладают повышенным сродством к одноцепочечным участкам ДНК и стабилизируют их в таком состоянии. Механизм действия основных ферментов репликации ДНК-полимераз таков, что синтез новой полинуклеотидной цепи не может начаться с включения в нее первого нуклеотида. Синтез идет только как удлинение уже существующего полинуклеотида, который комплементарен матрице и образует с ней двуспиральный комплекс матрица-затравка. Во всех живых системах такой затравкой служит не ДНК, а короткая РНК. РНК-затравка синтезируется ферментом праймазой (или РНК-полимеразой).

Элонгация. На этой стадии осуществляется синтез цепей ДНК. Каждый нуклеотид включается в цепь лишь в случае его комплементарности нуклеотиду, занимающему данную позицию в составе матрицы. Ферментный комплекс функционирует так, что одна из двух цепей растет с некоторым опережением по сравнению с другой цепью. Соответственно, первая цепь называется лидирующей, а вторая – запаздывающей. Важнейшее обстоятельство состоит в том, что лидирующая цепь образуется в виде непрерывного очень длинного фрагмента. Запаздывающая цепь образуется в виде серии относительно коротких фрагментов – примерно по 1500 нуклеотидов. Это т.н. фрагменты Оказаки. В виде фрагментов Оказаки синтезируется та цепь, направление образования которой противоположно направлению движения соответствующей репликативной вилки. Рост цепей ДНК осуществляется ферментами ДНК-полимеразами. Удлиннение цепи ДНК (или отдельного ее фрагмента) всегда происходит в направлении от 5’-конца к 3’-концу. Это означает, что очередной новый нуклеотид присоединяется к 3’-концу растущей цепи.

У прокариот известно три ДНК-полимеразы: ДНК-полимераза I, ДНК-полимераза II и ДНК-полимераза III.

ДНК-полимераза III у прокариот является основным ферментом. Он осуществляет синтез лидирующей цепи и фрагментов Оказаки в направлении 5’-3’ от 3’-ОН-затравки. Помимо ДНК-полимеразной активности, ДНК-полимераза III обладает еще одной – 3’-5’-экзонуклеазной. Последняя срабатывает в тех случаях, когда допущена ошибка и в строющуюся цепь включен «неправильный» нуклеотид. Тогда, распознав дефект спаривания оснований, фермент отщепляет с растущего (3’-) конца последний нуклеотид, после чего опять начинает работать как ДНК-полимераза. На лидирующей цепи ДНК-полимераза III движется вслед за хеликазой до конца репликона (или всей молекулы). На запаздывающей цепи ДНК-полимераза III доходит до РНК-затравки предыдущего фрагмента Оказаки и отделяется. На смену ДНК-полимеразе III приходит ДНК-полимераза I. Этот вспомагательный фермент имеет значительно меньший размер и обладает тремя ферментативными активностями. Первая из них – 5’-3’ – экзонуклеазная. За счет этой активности осуществляется последовательное отщепление нуклеотидов с 5’-конца РНК-затравки предшествующего фрагмента. На освобождающееся место фермент включает дезоксирибонуклеотиды, присоединяя их к 3’-концу «своего» фрагмента (ДНК-полимеразная активность). И, наконец, подобно ДНК-полимеразе III, ДНК-полимераза I может при необходимости корректировать свою работу с помощью 3’-5’ – экзонуклеазной активности. Работа ДНК-полимеразы I завершается, когда растущий фрагмент вплотную доходит до предыдущего фрагмента.

Что касается эукариот, то здесь функциональным аналогом прокариотической ДНК-полимеразы III является, видимо, комплекс α и δ -ДНК-полимераз; при этом корректирующая 3’ - 5’-экзонуклеазная активность присуща δ -ДНК-полимеразе. Функции ДНК-полимеразы I тоже распределены между двумя ферментами: 5’-3’ экзонуклеазная активность (удаление РНК-затравки) осуществляется, вероятно, специальной нуклеазой, а ДНК-полимеразная активность (застраивание брешей) β – ДНК-полимеразой  (другой ее функцией является репарация).

Для завершения репликации (терминации) используются ферменты лигаза и теломераза.

В результате действия предыдущих ферментов  новосинтезированная запаздывающая  цепь оказывается состоящей из фрагментов, вплотную примыкающих друг к другу (кроме кольцевой ДНК). «Сшивание» соседних фрагментов осуществляется ДНК-лигазой (фермент образует фосфодиэфирную связь). Для осуществления реакции требуется гидролиз АТФ.

ДНК-полимеразная система  оставляет недореплицированными 3’-концы материнских цепей ДНК, т.е. новые цепи оказываются укороченными с 5’-концов. В каждой новой цепи фрагмент Оказаки, находящейся у 5’-конца, как и обычно, начинается с короткой РНК-затравки (у 5’-конца лидирующей цепи тоже находится РНК-затравка). РНК-затравки удаляются специальной нуклеазой. Но застроиться дезоксинуклеотидами образующаяся «брешь» не может, поскольку ДНК-полимеразы не способны действовоать «с нуля», а лишь удлиняют 3’-конец уже имеющегося полинуклеотида. Поэтому получается, что новая цепь должна быть короче старой. Эта проблема решается при помощи фермента теломеразы. Теломераза удлинняет не новую, укороченную цепь, а старую, более длинную. К 3’-концу старой (родительской) цепи теломераза последовательно пристраивает несколько сотен повторяющихся последовательнотей. После чего значительно удлинненная старая цепь становиться способной выступать в качестве матрицы для образования еще одного фрагмента Оказаки новой (укороченной) цепи. Таким образом восстанавливается длина теломерного участка. Существуют и другие, альтернативные механизмы удлинения теломер. Теломерные участки необходимы для фиксации хромосом к ядерному матриксу, что важно при мейозе. Кроме того, наличие теломер предохраняет от недорепликации генетически значимые отделы ДНК. Наконец, теломерные отделы ДНК выступают в качестве «часового» устройства, которое отсчитывает количество делений клетки после исчезновения теломеразной активности. Каждое деление приводит к укорочению теломеры на 50-65 н.п. (кроме половых клеток, где активность теломеразы высокая).

Кроме рассмотренного, известен еще один тип репликации ДНК –  по типу «катящегося кольца». Так реплицируются кольцевые ДНК некоторых фагов, вирусов, митохондрий, плазмид. При этом способе в одной из цепей исходной ДНК происходит разрыв и освободившейся 5’конец присоединяется к клеточной мембране. На 3’-конце по комплементарной матрице неразорванной цепи начинается синтез дочерней цепи. При этом происходит вращение родительской молекулы, обеспечивающее «сползание» с нее удлиняющейся дочерней цепи. Последняя нарезается на куски, соответствующие по длине исходной молекуле ДНК. (см. Приложение). Такой способ репликации обусловливает образование многих копий материнской ДНК.

Организация генома.

 Различные организмы  резко отличаются по количеству  ДНК, составляющей их геномы. У  вирусов в зависимости от их  величины и сложности размер  генома колеблется от нескольких тысяч до сотен пар нуклеотидов. Гены в таких просто устроенных геномах расположены один за другим и занимают до 100% длины соответствующей нуклеиновой кислоты(РНК и ДНК). Для многих вирусов становлена полная нуклеотидная последовательность ДНК. У бактерий размер генома значительно больше. У кишечной палочки единственная нить ДНК – бактериальная хромосома состоит из 4,2х106(6 степень) пар нуклеотидов. Более половины этого количества состоит из структурных генов, т.е. генов, кодирующих определенные белки. Остальную часть бактериальной хромосомы составляют неспособные транскрибироваться нуклеотидные последовательности, функция которых не вполне ясна. Подавляющее большинство бактериальных генов уникальны, т.е. представлены в геноме один раз. Исключение составляют гены транспортных и рибосомальных РНК, которые могут повторяться десятки раз.

Геном эукариот, особенно высших, резко превышает по размерам геном прокариот и достигает, как отмечалось, сотен миллионов  и миллиардов пар нуклеотидов. Количество структурных генов при этом возрастает не очень сильно. Количество ДНК в геноме человека достаточно для образования примерно 2 млн. структурных генов. Реально имеющееся число оценивается как 50-100 тыс. генов, т.е. в 20-40 раз меньше того, что могло бы кодироваться геномом такого размера. Следовательно, приходится констатировать избыточность генома эукариот. Причины избыточности в настоящее время в значительной степени прояснились: во-первых, некоторые гены и последовательности нуклеотидов многократно повторены, во-вторых, в геноме существует много генетических элементов, имеющих регуляторную функцию, в-третьих, часть ДНК вообще не содержит генов

Строение гена.

 Согласно современным представлениям, ген, кодирующий синтез определенного  белка, у эукариот состоит из нескольких обязательных элементов. Прежде всего это обширная регуляторная зона, оказывающая сильное влияние на активность гена в той или иной ткани организма на определенной стадии его индивидуального развития. Далее расположен непосредственно примыкающий к кодирующим элементам гена промотор – последовательность ДНК длиной до 80-100 пар нуклеотидов, ответственная за связывание РНК-полимеразы, осуществляющей транскрипцию данного гена. Вслед за промотором лежит структурная часть гена, заключающая в себе информацию о первичной структуре соответствующего белка. Эта область для большинства генов эукариот существенно короче регуляторной зоны, однако ее длина может измеряться тысячами пар нуклеотидов.

 Важная особенность эукариотических  генов – их прерывность. Это значит, что область гена, кодирующая белок, состоит из нуклеотидных последовательностей двух типов. Одни – экзоны – это участки ДНК, которые несут информацию и строении белка и входят в состав соответствующих РНК и белка. Другие – интроны – не кодируют структуру белка и в состав зрелой молекулы и-РНК не входят, хотя и транскрибируются. Процесс вырезания интронов – «ненужных» участков молекулы РНК и сращивания экзонов при образовании и-РНК осуществляется специальными ферментами и получил название Сплайсинг (сшивание, сращивание). Экзоны обычно соединяются вместе в том же порядке, в котором они распологаются в ДНК. Однако не абсолютно все гены эукариот прерывисты. Иначе говоря, у некоторых генов, подобно бактериальным, наблюдается полное соответствие нуклеотидов последовательности первичной структуре кодируемых ими белков. Таким образом, ген эукариот во многом похож на оперон прокариот, хотя и отличается от него более сложной и протяженной регуляторной зоной, а также тем, что он кодирует обычно только один белок, а не несколько, как оперон у бактерии.