Симбиотические взаимоотношения микроорганизмов и растений

 

2.1.2.Определение влажности почвы

Берут сухой алюминиевый или стеклянный бюкс и взвешивают его с точностью до 0,1 г. Затем в него помещают навеску почвы 5 г и снова взвешивают. Затем бюкс помещают в сушильный шкаф и высушивают при T=100-105 0C до постоянной массы (обычно в течение пяти часов). После просушивания бюкс с почвой охлаждают в эксикаторе с CaCl2 на дне и взвешивают. Влажность рассчитывают по формуле:

W=100*a/b, где W – влажность почвы (%)

                            a – масса испарившейся воды (г)

                            b – масса сухой почвы (г)

масса бюкса пустого =23,6 г

масса бюкса с сырой почвой = 29 г

масса бюкса с сухой почвой – 28,6 г откуда,

b=28,6г – 23,6 г = 5

a=29 г- 28,6г= о, 4

Тогда W=100*0,4/5=8%

Масса абсолютно сухой почвы в 1 г свежей, рассчитывают по формуле:

m = 1- (W/100), где

W- полевая влажность в процентах(%).

m = 1-(8/100) =1-0,08=0, 92 %

 

2.1.3. Питательные среды

Группа микроорганизмов, выделяемая на плотных средах, состав и приготовление питательных сред.

1. Микроорганизмы, использующие органические формы  азота, выявляют на мясопептонном  агаре (МПА). Состав среды МПА:

Для учета бациллярных форм микроорганизмов по Е.Н. Мишустину рекомендуется применять смешанный агр – МПА +сусло=агар в отношение 1:1.

2.Для учета  актиномицетов можно использовать  среду Ваксмана. Состав среды Ваксмана:    

Для учёта бактерий использующих минеральные  формы азота и актиномицетов мы использовали среду Ваксмана. 3.Микроскопические грибы в почве определяют на среде Чапека или сусле – агаре (СА), указать состав выбранной среды:

4. Аэробные  целлюлозоразлогающие микроорганизмы  выявляют на среде Гетчинсона  с фильтровальной бумагой. Состав  среды:

5. Количество  аэробных азотфиксирующих бактерий  Azotobacter определяют методом обрастания комочков почвы на среде Эшби. Состав среды Эшби:

 

 

 

2.1.4.Методы исследования почвы.

Среднюю почвенную пробу получают смешиванием отдельных образцов, количество которых зависит от микрорельефа (ровный, волнистый, склон и т.д.) и площади. Н.К.Красильников рекомендует с площади 100 м2 брать пробу из трех точек, с более 100 м2 – их пяти, с гектара и более – из 15. При исследовании пашни пробы берут с глубины пахотного слоя, снимая верхний 2-х см слой, при изучении микрофлору почвенного профиля – по генетическим горизонтам (снизу вверх).

 Почвенный образец  берут стерильным буром, стерильной  лопатой и стерильным ножом  в заранее приготовленную стеклянную  широкогорлую стерильную банку, закрывающейся корковой пробкой, обернутой стерильной ватой, или стерильные полиэтиленовые мешки, или в мешки из пергаментной бумаги. На пакеты или банки наклеивают этикетки с указанием места взятия пробы, горизонта и др. необходимых сведений.

Бур, лопату и нож в поле перед взятием образца тщательно очищают, затем обжигаю горящим спиртом.

Почвенные образцы анализируют в первые сутки.

В случае необходимости допускают сохранение их в холодном помещение (в холодильнике) в течение двух дней. Для большей однородности среднего образца, соблюдая все условия асептики, его тщательно перемешивают, вынимают корни растений, различные включения (камни).

 

2.1.5.Приготовление почвенной суспензии и посев на питательные среды

На стерильное часовое стекло стерильным шпателем (или алюминиевой ложкой) помещают 10г почвы. Навеску почвы переносят в колбу емкостью 250 мл с 90 мл стерильной водопроводной воды, интенсивно взбалтывают вращательным движением (не смачивая пробки) 10 мин. Затем методом разведения готовят суспензии, содержащие разное количество почвы: из предыдущего разведения стерильной пипеткой переносят 1 мл суспензии в пробирку, содержащую 9 мл воды. В первой пробирке 1 мл суспензии, приготовленной по этому методу, соответствует разведению 10-1. 
Из полученных разведений делают посев на жидкие и плотные питательные среды. 
Если численность отдельных групп микроорганизмов в почве небольшая, их выявляют методом обрастания комочков почвы.

 

 

 

3.Результаты исследований

 

3.1.Учет количества микроорганизмов на плотных средах

 

После инкубации чашки засеянными средами вынимают из термостата и в них подсчитывают число колоний, просматривая в проходящем свете и отмечая на доношке чашки колонии маркером. Чтобы учесть и мелкие колонии чашки дополнительно просматривают под лупой.  Для учета выбирают то разведение, при высеве  которого на питательный агар выросло не менее 10 и не более ста колоний на чашке Петри. Для определения количества колониеобразующих единиц (КОЕ) в один г абсолютно сухой почвы проводят пересчет по формуле:

N= n*R*K/m, где

N – Численность микроорганизмов, большие КОЕ/г абс. Сух. Почвы;

n – Среднее значение подсчитанных на чашках одного разведения колоний, шт.

R – Разведение засеянной почвенной суспензии (для 10 -2 = 100, для 10 -3 = 1000, для 10 -4 =10000, для 10 -5= 100000, для 10 -6= 1000000)

K – коэффициент с учетом посеянной аликвоты почвенной суспензии ( для 1 мл = 1 мл, для 0,1 мл= 10, для 0,05 мл=20 мл, для 0,001 мл = 100 мл)

m – масса абсолютной – сухой почвы в 1 г свежей почвы.

 

 

 

 

 

 

3.2.Количественная характеристика микрофлоры исследуемого образца почвы

 

Общее количество колоний Среда и разведение	КОЕ/г	КОЕ/г доминирующие	Общее количество микроорганизмов в 1 г абс.сухой почвы.	Общее количество доминирующих в 1 г абс. сухой почвы
Среда МПА   10 -5 = 51       10-6=3,5	51*10-5       3,5*10-6	8*10-5        3*10-6	5543478       3804348	869565       3260869
Среда Ваксмана 10-3=110     10-2=11,5	110*10-3       11,5*10-2	48*10-3       22,5*10-2	119565       1250	52174       2445
Сусло-Агар 10-3=23   10-4=4,5	23*10-3     4,5*10-4	12*10-3     5*10-4	2500       48913	13043     54348

 

N= n*R*K/m,

1)Среда МПА N=51*100000*1/0,92=5543478

                         N=3,5*1000000*1/0,92=3804348

                         Nd=8*100000*1/0,92=869565

                         Nd=3*1000000*1/0,92= 3260869

2) Среда Ваксмана N=110*1000*1/0,92=119565

                                 N=11,5*100*1/0,92=1250

                                 Nd=48*1000*1/0,92=52174

                                 Nd=22,5*100*1/0,92=2445

3)Сусло-агар N=23*1000*1/0,92=2500

                       N=4,5*10000*1/0,92=48913

                       Nd=12*1000*1/0,92=13043

                       Nd=5*10000*1/0,92=54348

 

 

 

3.3Культурные и морфологические признаки доминирующих микроорганизмов

Среда	Культуральные признаки	Морфологические признаки	Предполагаемый возможный род (или группа), к которому можно отнести описываемый микроорганизм
МПА	Форма колонии - круглая Размер (мм)- 1,3-1,1 Цвет - желтый, бежевый Блеск - есть Поверхность -бугристая, гладкая Край - гладкий, зубчатый Структура - однородная Консистенция - маслянистая	Форма клетки - палочковидная Характер расположения - групповой Способность к спорообразованию - есть	Bacillus
Среда Ваксмана	Форма колонии – плотные кожистые Размер (мм)- 1,3-1,1 Цвет - желтый, бежевый Блеск - есть Поверхность -бугристая, гладкая Край - гладкий, зубчатый Структура - однородная	Форма клетки - палочковидная Характер расположения - групповой Способность к спорообразованию - есть	Streptomyces
Сусло-Агар	Форма колонии – круглая с неровными краями Размер (мм)- 4-7 мм Цвет – серо-зеленый Блеск - мучнистый Поверхность - шероховатая Край - неровный Структура – неоднородная Консистенция - рыхлая	Форма клетки – нитевидная ветвящиеся Характер расположения - групповой Способность к спорообразованию – есть                       Форма клетки – нитевидная ветвящиеся Характер расположения - групповой Способность к спорообразованию – есть	Mucor                         Aspergillus niger

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3.4.Количественная характеристика микрофлоры исследуемого образца почвы

 

Общее количество комочков	Количество обросших комочков	% от общего числа
Среда Эшби   50 (среднее)	39,5 (среднее)	79 %
Среда Гетчинсона   50 (среднее)	37,5 (среднее)	75%

 

1)50 – 100%                        2)50-100%            

39,5 – х %                           37,5-х%    

Х=39,5 *100/50=79%         х=37,5*100/50=75%

 

3.5.Культурные и морфологические признаки доминирующих микроорганизмов

 

 

Среда	Культуральные признаки	Морфологические признаки	Предполагаемый возможный род (или группа), к которому можно отнести описываемый микроорганизм
Среда Эшби	Форма колонии - округлая Размер (мм)- 4-6 мм Цвет - бурый Блеск – жирный Поверхность - гладкая Край - ровный Структура – однородная Консистенция - слизистая	Форма клетки - палочковидная Характер расположения - групповой Способность к спорообразованию - нет	Azotobacter
Среда Гетчинсона	Форма колонии - округлая Размер (мм)- 4-6 мм Цвет - бурый Блеск – матовый Поверхность - гладкая Край - ровный Структура – однородная Консистенция - слизистая	Форма клетки - палочковидная Характер расположения - групповой Способность к спорообразованию - нет	Cytophaga

 

 

 

 

 

3.6.Результаты и анализы сравнения все трех видов почв

 

 

В ходе курсового посева было рассмотрено три вида почв. Для анализа сравнения необходимо рассмотреть все три вида, так как необходимо изучить и понять: какая среда более благоприятна, а какая не благоприятна для развития тех или иных организмов, какие формы микроорганизмов и в каком количестве преобладают в той или иной почве.

 

Сводная таблица

Почва	Общее количество микроорганизмов на МПА, КОЕ/г	Общее количество микроорганизмов на среде Ваксмана, КОЕ/г	% обросших комочков на среде  Эшби		% обросших комочков на среде  Гетчинсона
Чернозём	7171717	43535	37,7		99
Загрязнённая почва	2395000	155800	92		91
Светло-каштановая почва	5543478	119565		79	75

 

Среда Эшби

-Для определения качественного состава почвы и относительной оценки населенности почвы целюлозоразрушающими микроорганизмами

 

 

Рис 1 Характеристика микрофлоры исследуемого образца почвы. Среда Эшби

 

Появление налета вокруг комочков свидетельствует о наличии свободноживущих азотфиксирующих бактерий.

 

 

Среда Гетчинсона

- применяется для учета аэробных целлюлозоразлагающих микроорганизмов.

 

Рис 2. Характеристика микрофлоры исследуемого образца почвы. Среда Гечинсона

 

На представленных образцах во всех трех почвах мы можем наблюдать благоприятные условия для развития аэробных целлюлозоразлагающих микроорганизмов. Об этом свидетельствует обрастание комочков.

 

 

Среда МПА

-для качественного  анализа сапротрофной микрофлоры, использующих в качестве источника питания органические формы азота.

 

Характер роста на агаре, цвет, край, форма, размера (приблизительный) и консистенция колонии помогает нам выявить сапрофитных микроорганизмов.

 

Среда сусло-агар

- предназначено для культивирования, выделения, учёта или накопления грибов, в частности дрожжей.

 

Рис. 5 Характеристика микрофлоры исследуемого образца почвы. Среда Сусло-агар

 

Метод основан на аспирации из воздуха клеток дрожжеподобного гриба на поверхность среды сусло-агар и подсчета выросших колоний.

Поэтому на данных почвах хорошо развиты бактерии, тогда как микроскопических грибов проросло небольшое количество и только на сусло-агаре.