Симбіотична фіксація молекулярного азоту

 

 

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ України

НАЦІОНАЛЬНИЙ ТЕХНІЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ УКРАЇНИ

“Київський політехнічний інститут”

 

Факультет біотехнології і біотехніки

Кафедра промислової біотехнології

 

РЕФЕРАТ

з дисципліни «Анатомія та фізіологія рослин»

на тему «Симбіотична фіксація молекулярного азоту»

 

Виконав:

студент 1 курсу, група БТ-31

_____________ Буренко Ілона Олегівна

підпис

№ залікової ______________________

Робота здана _____________________

Перевірив:

доцент каф. промислової біотехнології, к.б.н.

_______________ Богдан Т. з.

підпис

Роботу зараховано ________________

дата

з оцінкою________________________

 

 

 

 

 

Київ 2014 

ЗМІСТ

 

 

 

 

Вступ

Азот є абсолютно необхідним елементом для всіх живих організмів. Основним резервуаром азоту служить земна атмосфера. Еукарітичні організми не здатні засвоювати азот безпосередньо з атмосфери. Таку здатність має обмежена кількість видів прокаріот, яких називають азотфіксаторами, а процес зв'язування азоту атмосфери цими організмами - біологічної азотфіксації. Багато рослин, тварини і грибів здатні вступати в симбіоз з азотфіксуючими прокаріотами. Найбільш інтенсивно азотфіксація протікає при утворенні вторинний ендосимбіозу, коли мікроорганізм проникає всередину тканин або навіть в клітини господаря. При цьому мікросимбіонт забезпечується поживними речовинами і енергією, необхідною для розриву потрійний зв'язку N2, а господар отримує легко засвоюваний азот. Біологічна азотфіксація являє собою глобальний процес, що забезпечує існування життя на Землі. Загальна світова біологічна фіксація азоту становить 17,2 т/рік, що в чотири рази перевищує зв'язування N2 у формі NH3 на підприємствах хімічної промисловості. При цьому продуктивність симбіотичної азотфіксації складає 100-400 кг N/га.

 

РОЗДІЛ 1

Фіксація азоту бульбочковими бактеріями

1. Історія відкриття симбіотичних азотфіксуючих мікроорганізмів

Вперше прямі докази наявності азотфіксуючих мікроорганізмів, що живуть в симбіозі з бобовими рослинами, були отримані завдяки роботам німецького дослідника Германа Гельрігеля. Порівнюючи джерела азоту для злаків і бобових (1886 рік), він показав, що якщо злаки черпають азот з мінеральних речовин ґрунту, то бобові, крім того, спроможні фіксувати азот повітря. Таку здатність бобових Гельрігель пояснював наявністю на кореневій системі бульбочок (рис.1), розвиток яких викликають мікроорганізми.

Рис. 1 Бульбочки на коренях бобових рослин

Після робіт Гельрігеля стало ясно, що фіксація рослинами азоту пов'язана з мікроорганізмами, які інфікують кореневу систему рослини. Знадобилося близько десятка років для підтвердження висновків Гельрігеля про значущість симбіотичних мікроорганізмів роду Rhizobium для бобових рослин як азотфіксаторів. Голландський бактеріолог М. Бейерінк виділив у 1888 році клітини Rhizobium в чистій культурі. Надалі була показана їх здатність інфікувати кореневу систему бобових з певним ступенем вибірковості по відношенню до конкретних видів рослин і викликати утворення на корінні бульб  -  спеціалізованих утворень, в яких протікає азотфіксація.

Зараз відомо близько 13 тис. видів бобових, багато з яких володіють здатністю до симбіотичної фіксації азоту. Для кожного виду бобових рослин є свої різновиди (штами) Rhizobium, які й отримали свої назви від назв господаря (Rhizobium trifolii - бульбочкові бактерії конюшини, Rhizobium lupini - бульбочкові бактерії люпину і т.д.).

З'ясовано також, що водна папороть Azolla знаходиться в симбіотичних відносинах з азотфіксуючими ціанобактеріями. Деякі дерева і чагарники (наприклад, вільха, обліпиха, восковик) мають в якості симбіонтів актиноміцети.

2. Бульбочкові бактерії

Найбільший внесок в біологічну азотфіксацию здійснюють бульбочкові бактерії (рис. 2). Вони являють собою грамнегативні бактерії, що утворюють бульби з рослинами сімейства бобових. Бульбочкові бактерії тепер ділять на п'ять родів: Azorhizobium, Rhizobium Mesorhizobium, Sinorhizobium і Bradyrhizobium.

Рис. 2 Мікрофотографія бульбочкових бактерій

Для бульбочкових бактерій характерно розмаїття форм - поліморфність. Бульбочкові бактерії можуть бути паличкоподібними і овальними. Серед цих бактерій зустрічаються також фільтруючі форми, L-форми, коковидні нерухомі й рухомі організми.

Молоді бульбочкові бактерії в чистій культурі на поживних середовищах зазвичай мають паличкоподібну форму (рис. 3), розмір паличок приблизно 0,5 - 0,9 х 1,2 - 3,0 мкм, рухливі, розмножуються поділом.

Рис. 3 Бактеріоїди бульбочкових бактерій конюшини.

У паличкоподібних клітин бульбочкових бактерій конюшини спостерігається поділ перешнуруванням. З віком паличкоподібні клітини можуть переходити до брунькування. За грамом клітини фарбуються негативно, ультратонка структура їх типова для грамнегативних бактерій  
(рис. 4).

Рис. 4

При старінні бульбочкові бактерії втрачають рухливість і переходять у стан так званих оперезаних паличок. Таку назву вони отримали внаслідок чергування в клітинах щільних і нещільних ділянок протоплазми. Смугастість клітин добре виявляється при перегляді в світловому мікроскопі після обробки клітин аніліновими барвниками. Щільні ділянки протоплазми (пояски) зафарбовуються гірше, ніж проміжки між ними. У люмінесцентному мікроскопі пояски світло-зелені, проміжки між ними не світяться і виглядають темними. Пояски можуть розташовуватися всередині клітини або на кінцях. Оперезаність клітин видно і на електронограмах, якщо препарат перед переглядом не обробляти контрастуючими речовинами. Імовірно, з віком бактеріальна клітина наповнюється жировими включеннями, не сприймаючи забарвлення, і цим зумовлена смугастість клітини. Стадія «оперезаних паличок» передує стадії формуванню бактероїдів - клітин неправильної форми: потовщених, розгалужених, сферичних, грушоподібних і колбоподібних (рис. 5).

Рис. 5 Бактеріоїди бульбочкових бактерій конюшини.

Термін «бактероїди» ввів в літературу Дж. Брунхорст в 1885 р., застосувавши його до незвичайних за формою утворень, значно більшими, ніж паличкоподібні клітини бактерій, що зустрічаються в тканинах бульбочок.

Бактероїди містять велику кількість волютинових гранул і характеризуються більш високим вмістом глікогену і жиру, ніж паличкоподібні клітини. Бактероїди, вирощені в штучних поживних середовищах і утворилися в тканинах бульби, фізіологічно однотипні. Є думка, що бактероїди - це форми бактерій з незавершеним процесом поділу. При незавершеному діленні клітин бульбочкових бактерій виникають дихотомічно розгалужені форми бактероїдів. Кількість бактероїдів збільшується при старінні культури ; їх появі сприяють виснаження живильного середовища, накопичення продуктів обміну, внесення в середу алкалоїдів.

3. Механізм азотфіксації

У основі здатності інфікувати кореневу систему господаря лежить складний і не цілком зрозумілий молекулярний механізм, що має вирішальне значення в симбіотичної фіксації азоту. На першому етапі відбувається наближення мікробної клітини до рослини за рахунок її здатності пересуватися у відповідь на впізнавання хімічних продуктів, що виділяються з коріння рослини (хемотаксис). Відбувається контактна взаємодія мікроорганізму з рослиною. У цьому процесі важливе місце відводиться так званому  
лектин-вуглеводному впізнаванню рослини мікроорганізмом. Лектин (рис. 6) кореневих волосків рослин впізнає вуглевод поверхно ¬ стибактерій і міцно зв'язується з ним.

Рис. 6 Лектин - поверхневий гемаглютиніни.

 Відбувається взаємопізнавання  партнерів і підготовка до формування симбіотичної системи. Рослина в нано- або пікомолярних концентраціях починає продукувати специфічні флавіноіди, які активують гени вірулентностісти ризобій. Nod-гени кодують синтез Nod-акторів (ліпоолігосахарідов), які викликають у рослини-хазяїна скручування кореневих волосків та утворення бульбочкової меристеми. У місці різкого згину волоска пектолітичні ферменти рослини руйнують клітинну стінку, через яку бактерії і проникають всередину. Навколо цих бактерій утворюється порожнина - інфекційна нитка, стінки її утворені рослинними клітинами, а внутрішній простір заповнене полісахаридами рослини і мікросимбіонта.

Далі відбувається ендоцитоз ризобій з інфекційної нитки всередину клітин рослини-хазяїна. У цитоплазмі рослинної клітини бактерії оточуються спеціальними перібактеріоїдними мембранами (ПБМ), синтезуються в основному рослинною клітиною і частково ризобії. Кількість ризобіальних клітин усередині ПБМ залежить від виду рослин і звичайно становить від 1 до 10 клітин. Бактеріальні клітини, оточені загальною ПБМ, називаються симбіосомою і є основною структурно - функціональною одиницею симбіозу.

Незабаром ризобії в ПБМ перетворюються в особливі симбіотичні форми-бактероїди, які мають в три-п'ять разів більші розміри, ніж вільноживучі бактерії. Все це сприяє формуванню на поверхні коренів бульбочок. Азотфіксуюча бульбочка (рис. 7) складається з наступних частин: а)інфікована бактеріями тканина, б)провідна тканина, що поставляє вуглеводи і та, що виносить продукти азотфиксації, в)меристема, за рахунок якої йде зростання бульби. Морфологія і число бульбочок строго визначається рослиною-господарем, що, можливо, пов'язано з більшою енергоємністю їх утворення.

Рис. 7 Азотфіксуюча бульбочка

Бульбочкові бактерії більш економно використовують енергію, необхідну для фіксації азоту, зачіпаючи 3-4 г вуглеводів на 1 г азоту, в той час як вільноживучі азотфіксуючі бактерії витрачають 50- 100 і більше грамів на фіксацію 1 г азоту. Це пов'язано з тим, що у вільноживучих азотфіксаторів фіксація азоту відбувається в процесі їх росту, і тому велика кількість енергії витрачається на це. Окрім того, в цілях створення сприятливих умов для активності нітрогенази – фермента, що приймає участь у фіксації азоту, для зниження парціального тиску кисню посилюється дихання, що пов’язано з витратами енергії. Ці витрати енергії відсутні у бульбочкових бактерій, оскільки фіксація азоту відбувається в бактероїдах - клітинах, які припинили ріст, а всередині бульбочок  створюються сприятливі умови для активності нітрогенази, в тому числі знижений вміст кисню. Суттєво те, що азот, який фіксується бульбочковими бактеріями, на 90-95% передається бобовим рослинам. Бобові, отримуючи зв'язаний азот від бульбочкових бактерій, не залежать або мало залежать від забезпечення мінеральним азотом грунту і тому можуть успішно проростати спільно з іншими рослинами на грунтах, бідних доступними формами азоту. Кількість азоту, що фіксується бульбочковими бактеріями бобових, сильно варіює від фітоценозу до фітоценозу, а в межах конкретних фітоценозів може змінюватися від року до року. Вона визначається участю бобових у фітоценозах, умовами середовища та ефективністю відповідних рас бактерій. Для деяких лугів в Новій Зеландії з травостоями, де переважає конюшина, зареєстрована фіксація азотом до 450 - 550 кг/га.

Загальний рівень азотфіксуючої активності вільноживучих організмів невисокий. Залежно від виду та умов існування вони накопичують в рік від 10 до 30 - 40 кг пов'язаного азоту на гектар.

 

 

РОЗДІЛ 2

Біохімія азотфіксації

1. Нітрогеназа як основний фермент симбіотичної азотфіксації

Мікроорганізми, що засвоюють молекулярний азот, називаються діазотрофи. Основним елементом симбіозу є нітрогеназа (рис. 8) - багатовимірний фермент, що складається з комплексу двох білків: MoFe - білка і Fe - білка.

Рис. 8 Нітрогеназа

Нітрогенази з різних азотфіксаторів трохи різняться своїми молекулярними масами і вмістом металів. Кожен з білків, у свою чергу, складається з кількох субодиниць. Молекулярна маса MoFe-білка різноманітних нітрогеназ знаходиться в межах 200-250 кДа. Фермент містить по два атома молібдену,  28-34 атома заліза і 18-24 атома сірки на одну молекулу. Молекулярна маса Fe-білка коливається від 50 до 70 кДа і також містить атоми заліза й сірки. Нітрогеназа синтезується в бактеріоїдах і є каталізатором фіксації азоту:

N2 + 8[H] + 2

à 2 + Н2

Цей процес вимагає витрати енергії. За розрахунками для клітин Rhizobium відновлення однієї молекули N2 вимагає витрати 25-35 молекул АТФ, тобто на кожен грам фіксованого азоту витрачається 3-6 грам органічного вуглецю. Крім АТФ потрібні також відновлені піридиннуклеотид і ферредоксин як відновлювана сила.

Споживання рослинами аміаку, що утворився при азотфіксації або відновленні нітратів грунту, здійснюється ферментами, пов'язаними з біосинтезом первинних амінокислот, насамперед глутамінової, аспарагінової кислот та їх амідів. Одним з активно досліджуваних ферментів є, наприклад, глютамінсінтетаза. Цей фермент каталізує реакцію:

глутамінова кислота + NH3 + АТФ à глутамін + AДФ + Pi.

Цей фермент зустрічається у всіх організмах і бере участь у приєднанні аміаку до глутамінової кислоті з утворенням її аміду й подальшим використанням його в різних реакціях синтезу азотвмісних органічних сполук. Близьким за механізмом дії є й аспарагінсінтетаза:

аспаргінова кислота + NH3 + АТФ à аспарагін + AДФ + Pi.

Синтез амінокислот і амідів відбувається за участю ще й інших ферментів: глутаматдегідрогенази, аспартази і т.д. Зрештою азот у вигляді аміногруп втягується в серію біосинтетичних реакцій організму, підтримуючи його життєві функції.

2. Механізм біологічної азотфіксації

Атоми в молекулі азоту (N2) з'єднані трьома міцними ковалентними зв'язками. У азотфіксаторів інтенсивність енергії обміну, зокрема об’єм споживання кисню, значно вище, ніж у бактерій, не здатних фіксувати азот.

Молекулярний азот через щілину, що відповідає довжині молекули азоту, надходить всередину ферменту й активується. У результаті активації й хемосорбції азоту нітрогеназою вивільняється енергія й відбувається розрив двох зв'язків у молекулі азоту. Третій зв'язок розривається при впровадженні в молекулу активованого азоту: водню, активованого ферментами дегідрогеназної і гідрогеназної систем. Добутий аміак або інші відновлені продукти азоту реагують з кетокислотами, утворюючи амінокислоти (рис. 9)