Өсімдіктерді клонды микрокөбейту

Өсімдіктерді клонды микрокөбейту.

Жасушалар мен тіндер культурасындағы жетістіктер вегетативті көбеюдің ұстамалы жаңа  әдісі  – клоналды микрокөбейтуге әкелді.

Бұл in vitro жағдайында пробиркаларда бастапқы нұсқаларға генетикалы ұқсас жыныссыздық жолмен өсімдіктерді алу.  Әдіс  негізінде зарарсыз жағдайда қоректік ортаға салынған әр түрлі арнайыланған тіндердің, жасушалардың ерекше қабілеті, оларға тән тотипотенттігін іске асыру жатады, яғни экзогенді әсерлер күшімен бүтін өсімдіктік организмге бастау беретін қасиеті білінеді.

Клоналдық микрокөбейтудің алғашқы жетістіктер 20 ғасырдың 50жылдарының аяғында Француз ғалымы Ж.Морель арқасында мүмкін болды, ол архидеяның алғашқы өсімдік-регенерантын ала алды. Ж.Морельді микрокөбейтудегі табысына in vitro жағдайында өсімдіктердің апекалдық меристемасын күтінудегі сол кезде жасалған техникасы мүмкіндік берді. Әдетте алғашқы экспланд есебінде зерттеушілер шөптік өсімдіктердің: қалампыр, бақытгүл,  хризантема , күнбағыс, асбұршақ, жүгері, үлпілдек, сүт шөп апекалдық меристемаларын пайдаланған және өсімдіктердің регенерациясымен қалыптасу үрдістеріне қоректік заттың құрамының әсерін зерттеген. Жыныссыз көбеюмен алынған өсімдіктерді белгілеу үшін АҚШ-тың ауыл шаруашылығы министрлігінен Уебер 1903жылы «клон» терминін ұсынды. Жыныссыз жолмен көбейген өсімдіктің ұрпақтары жекеліксіз деп саналады. Олар тек аналық дараның бөліктері, соған және өзара ұқсас.Сонымен клоналдық микрокөбейту – бұл алғашқыға ұқсас өсімдіктерді жылдам, жыныссыз жолмен алу үшін in vitro техникасын пайдалану.Өсімдіктердің тіндік және жасушалық культураларын жылдам клоналдық микрокөбейту және өсімдіктер сауықтыруды қолданумен қатар өсімдік текті бағалы ББЗ өндірісті тәсілмен, оған қоса рекомбинанттық ДНҚ технологиялары негізінде трансгендік өсімдіктерді алуда пайдаланылады.

Клоналдық микрокөбейту  әдістері .

Клоналдық микрокөбейтудің бірнеше  әдістері  бар. Экспланттарды күтуде морфогенездің ерекшеліктеріне,  өсіру  жағдайларының өзгерісіне, олардың реакцияларына, клоналдық микрокөбейтудің ақырғы нәтижелеріне сәйкес келесі  әдістерді  бөледі:

•Өсімдікте бар меристемалардың дамуын белсендендіру;

•Экспланттың тура тіндерімен адвентивтік бүршіктердің пайда болуымен қоздыру (индукция);

•Сомалық эмбриогенезді қоздыру (индукция)

•Алғашқы және жаңадан салынған каллустық тіндерде адвентивтік бүршіктердің жетілдірілуі.

Бұл  әдістерді  in vitro жағдайында өсімдіктердің тінін күтудің 2 типіне біріктіруге болады:

•Бірінші интакттық өсімдікте бар меристемалардың белсенділігі нәтижесінде алынады (сабақ апексі, қолтық және ұйқыдағы бүршіктер). Бұл өсімдіктер генетикалық толықтай аналық түрлерге ұқсас, өйткені культура жағдайында апекстер көп жағдайларда генетикалық тұрақты;

•Екінші типі өсімдіктер, бүршіктер немесе эмбриондар пайда болуының индукциясы нәтижесінде алынады. Бұлар культурада генетикалық өзгергіштігімен сипатталатын арнайылы және калустық жасушалардан алынған өсімдіктер аналық түрінен бірталай айырмашылығы болуы мүмкін, мұндай  әдісті  тек сол өсімдіктерге қолдануға болады, егер каллус генетикалық тұрақтылығымен ерекшеленсе немесе өсімдік – регенераттар арсындағы вариабелділік табиғи өзгергіштік деңгейінен аспайтын болса.

Сонымен, клоналдық микрокөбейтуде қолданылатын негізгі  әдіс  – бұл өсімдікте бар меристемалардың дамуын белсендіру. 1949 жыл анықталғандай апекалдық меристема сабақ ұшында орналасқан және жетілдірілмеген жасушалардан тұратын 0,1-0,2 мм-ден аспайтын аз бөлігі болады, бөлік үздіксіз өседі және өсімдік ағзаларын түзеді. Меристемалық тін эмбрионалдық белсенді күйде үзіксіз ұсталады. Ол генетикалық өзгерістерге төзімді, бұл ДНҚ репарациясы жүйерінің жоғары белсенді салдары болуы мүмкін.

Меристемалық тіннен клоналдық микрокөбейтудің екінші түрі – күтілетін экспланттың тура тіндерімен адвентивтік бүршіктер немесе қосымша өркендердің пайда болуын қоздыру. Адвентивтік бүршіктер тәрізді меристемалы жасушалардың беттік қабаттарынан (эпидермалдық немесе субэпидермалдық) қалыптасады. Мұндай қосымша өркенлердің үдеуі бүтін өсімдіктерді түзілуіне әкеп соғады. Адветивтік бүршіктерді түзілуін өсімдіктің кез-келген ағзалары мен тіндерінен алуға болады. Әдетте бұл үдері бір цитокининді немесе ауксиемен бірге болатын қоректік ортада жүреді. Ауксин есебінде мұндай жағдайда β-индолил-3сіркеқышқылын жиі қолданады. Бұл жоғары өсімдіктердің ең кең тараған  әдісі . Бұл  әдіс  көбінесе өсімдіктерді көбейтуде қолданылады, олар табиғи жағдайларда өте баяу көбейеді.

Қолайлы жағдайларда каллус белсенді бөліне бастайды, меристемалық ошақтарды қалыптастырады және не бүршікті, не эмбриойдты бастауға кіріседі. Каллустық жасушалардың генетикалық тұрақтылығы болмайтынын ескеріп, in vitro жағдайында күтілуде алғашқы каллусты пайдаланған дұрыс, оған қоса каллустың ұйымдаспаған өсуі кезінде уақыттың мерзім мүмкіндігінше қысқа болған ыңғайлы.

Дәстүрлік  әдістерге  қарағанда өсімдіктердің клоналдық микрокөбейту артықшылығына келесілер жатады:

1.Көбейтудің әлде қалай жоғары  коэффициенті, ол жылына 105-106микроклондарға  жетеді, ал сол мерзімде дәстүрлі  жолмен әдеттен біреуден 5-100 өсімдік  алынады. Тіндер культурасы арқылы  көбейткенде гербер, бүлдірген,  хризантема , раушан өсімдіктеріні  біреуінен жылына 1 млн-нан аса  өсімдік алуға болады. Егер шөптесін  гүлді өсімдіктердің көбею коэффициенті 105-106 тең болса, бұталы ағаштар  үшін ол – 102-104 , қылқан жапырақтылар  үшін- 104 .

2.Аналық және көбейтілудегі  өсімдіктер алып жатқан алаңдарды  үнемдеуге әкелетін үдерістің  миниатюризациясы;

3.Жылдың кез-келген маусымында  жұмыс жасау мүмкіндігі

4. Егілген материалда патогендік  микрооргнаизмдерден, вирустардан  сауықтыру.

5.Дәстүрлі тәсілдермен қиын  көбейетін өсімдіктерді көбейту.

а) клоналдық микрокөбейтудің кезеңдері мен техникасы.

Бірінші кезең – өсімдік донарды таңдау эксплантты бөліп алу және зарарсыздау, in vitro жағдайында қоректік ортада оның өсуіне жағдай жасау(32-сурет). Жұмыстың табысты болуы, донорлы өсімдіктің өсуі мен дамуының жағдайларын ескеріп, эксплантты дұрыс таңдауға байланысты. Күту үшін эксплантқа байланысты әр түрлі қатынаста болатын минералды тұздар, әр түрлі ББЗ мен өсу белсендіргіштері (ауксиндер, цитокинидер) бар Мурасиге мен Скуг ортасын пайдаланады, қоректік ортаға уытты заттардың бөлінуі салдарынан алғашқы экспланттың өсуін басылуы байқалса, онда оның өсуін антиоксиданттарды пайдалану арқылы күшейтуге болады. Бірінші кезең ұзақтығы 1-2 ай, соның нәтижесінде меристемалық тіндердің өсуі және алғашқы өркендердің қалыптасуы байқалады.

Екінші кезең- микроөсірудің өзінің жолы:

А) экспланттың барлық қолтық бүршіктерінің дамуын белсендіру нәтижесінде бастапқы және де жаңадан пайда болған өркендердің апикалдық басымдылығын басу;

Б) апикалдық басымдылықты сақтаған өркендердің микроқалемшеленуі;

В) жапырақтық, сабақ тіндерімен (буылтықтық қабыршақтары мен түбіртегімен), тамырсабақпен, гүл шоғырларының өсінділеріменадвентивтік бүршіктер түзілуін белсендіру. Бұл кезеңде мериклондардың жиналуына қол жеткізу қажет, мұнда субкүту артқан сайын қалыптан ауытқыған морфологиялы өсімдік-регенеранттар көбейетінін және өсімдік-мутанттар түзілу мүмкіндігін еске алу керек. Өсудің тиісті реттеушілерімен тағы да Мурасиге және Скуг ортасы қолданылады. Цитокиндердің -1-10мг/л дейін құнарлықта бензиламинопурин (БАП), ал ауксиндермен – ИУК-пен НУК 0,5мг/л құнарлықта ең жиі қолданылады.

Үшінші кезең – көбейген өркендердің тамырлануы және in vitro жағдайларына пробиркалық өсімдіктердің бейімделуі.

Қалыпты тамыр жүйесінің дамуын қамтамасыз ету қажет. Бұл үшін қоректік ортаға лизогендік себепкер шарт – ауксидерді қосады. Тамырлар пайда болғаннан кейін өсімдіктерді топыраққа өсуге дайындайды, не төменгі температурада сақтауға қояды (депомдау). Бұл өсімдіктердің дамуын тоқтатады және оларды ұзақ уақыт сақтауға мүмкіндік береді, кейін керек уақытында пайдалана береді.

Бұл кезеңде әдетте ортаның негізгі құрамын алмастырады: Мурасиге Скук рецепті рецепті бойынша құнарлығын 2-4 есе азайтады. Қант мөлшерін 0,5-1 %-ға дейін төмендетеді және ауксиндерді ғана қалдырып, цитокининдерді тіпті қоспайды. Белсендіргіш есебінде тамыр түзеу үшін β-индолил -3-майқышқылын (ИМҚ), ИУК немесе НУК пайдаланылады.

Микроөркендердің тамырлануын екі тәсілмен жүргізеді:

1.Ауксиннің (20-50мг/л) зарарсыз құнарландырылған  ерітіндісінде бірнеше сағат (2-24сағ) микроөркендерді ұстайды және  оларды кейін гормонсыз агарлық  ортада немесе тура тиісті  топырақтық субстратта күтеді.

2.Төмен құнарлықта ауксині бар (1-5 мг/л, нысанға байланысты) қоректік  ортада 3-4 апта бойы микроөркендерді  тура күту.

Төртінші кезең – топырақта немесе жасанды субтратта жылыжай жағдайында күту ыдыстардан алынған өсімдіктерді  өсіру . 

Іске асыруға немесе жерге егуге дайындық. Ауаның ылғалдылығын жоғарылатады және жарықтану қарқынын арттырады. Өсімдіктер гетеротрофтық қоректенуден автротрофтыққа ауысады.Пробиркалық өсімдіктерді егу үшін ең қолайлы уақыт – көктем немесе жаздың басталу кезеңі. Екі-үш жапырақтармен жақсы дамыған тамыр жүйесі мен өсімдіктерді ұзын ұшты пинцеттермен колбалар немесе пробиркалардан сақтықпен алады. Тамырларды агар қалдықтарынан жуып алады және алдын ала 1-2 сағ бойы 80-900С-та зарарсыздандырылған топыырақтық субстратқа отырғызады. Көптеген өсімдіктер үшін субстрат есебінде әр түрлі қатыста келесілер қолданылады: торф, құм, перлит, шым топырақ. Егілген өсімдіктерді реттілетін температуралық тәртіппен (20-220С)жарықтығы 5 мың лк және ылғалдығы 65-90% жылыжайға орналастырады. Егілгеннен 20-30 күннен кейін жақсы тамырланған өсімдіктерді минералдық тұздармен қоректендіреді. Пробиркалық өсімдіктердің топырақтық жағдайларға бейімделу үдерісі ең қымбат және еңбек етуді қажет ететін операция. Өсімдіктерді топыраққа еккеннен кейін, өсудің тоқталуы , жапырақтың түсуі және өсімдіктердің құрғауы жиі байқалады. Бұл бірінші кезекте пробиркалық өсімдіктерде тыныс тесігі аппаратының жұмысы бұзылуына байланысты, сол себепті судың көп бөлігі рәсуа болады. Екіншіден in vitro жағдайында кейбір өсімдіктерде тамыр түктері түзілмейді, ал бұл өз кезінде топырақтан су мен минералды тұздардың сіңірілуінің бұзылуына әкеліп соқтырады. Сондықтан клондық микрокөбейтудің үшінші және төртінші кезеңдерінде өсімдіктердің жасанды микоризациясын (микофактар үшін) қолданған дұрыс, мұнда олардың өсімдіктерді минералдық және органикалық қоректік заттармен, сумен, ББЗ-мен қамтамасыз етуде және өсімдіктерді патогендерден қорғауға жағымды ролін есепке алады. Өсімдіктерді микориздік саңырауқұлақтармен жұқтыру, оларды азотпен қамтамасыз етуін жақсартып, 1,5-2 есе бекуін жоғарылатады және өсімдіктердің жер бетіндегі биомассасын арттырады.

Б) ӨСІМДІКТЕРДІ КЛОНАЛДЫҚ МИКРОКӨБЕЙТУ ҮДЕРІСІНЕ ӘСЕР ЕТУШІ СЕБЕПКЕР ШАРТТАР

 Өсімдік генотипі микрокөбейту  бойынша жұмыстың табыстылығын  көп жағдайда анықтайды, өйткені  өсімдіктер регенерацияларының in vitro жағдайында жылдамдығы түрге  байланысты. Мысалы, қосжарнақты шөптесін  өсімдіктер дара жарнақтылар  мен ағаш өсімдіктерге қарағанда  өте айқын қайта түзілу қабілетіне  ие. Өсімдіктің әрбір түрі үшін  қайта түзілудің ең тиімді  әдісі  таңдалады. Эеспланттарды  бөлетін өсімдіктер сау болуға  тиіс, оларды ауаның төмен ылғалдылығында, шектелген суарумен, жапырақтарға  су шашыратпай жылыжайларда өсіреді. Эксплантты таңдап алу өте  маңызды роль атқарады. Ең жақсысы  меристемалық белсенді тіндер  мен мүшелерді пайдалану: өркендердің  жоғарғы жағы, меристеманың қолтықтық  бүршіктері. Олар культурада жақсы  сақталады, өсудің жоғары жылдамдығына  және тотипотенттілікке ие. Бастапқы  өсімдіктің жасы, алғашқы экспланттың  көлемі, эксплантты оқшаулау уақыты (маусым) сияқты физиологиялық шамалар  елеулі әсер етеді. Жасы артқан  сайын әдетте бастапқы материалдың  өркендері мен қалемшелерінің  тамырлану қабілеті төмендейді. Өсімдіктің вегетациясы кезінде  оқшауланған тіндері мен мүшелері  қоректік заттың құрамына ең  жоғары сезімталдығына ие және  өте жиі адвентивтік бүршіктер  түзуге, өркендер қалыптастыруға  және тамырлануға, басқа мезгілдерге  қарағанда қабілетті.

Күту жағдайлары- минералдық тұздар, көмірсулар, фитогормондар, витаминдер, т.б. бойынша қоректік ортаның тепе-теңдігі. Көмірсулардың жиі 3% сахароза және глюкоза, фруктоза, галактоза, т.б. пайдаланылады. Қоректік орта рН күту нысанына байланысты 5,0-5,8 шегінде вариацияланады және зерттелген өсімдіктердің табиғи өсетін топырағының қышқылдығын есепке алады. Температура метаболиттік үдерістерді белсендіріп, өсімдіктердің оқшауланған тіндерінің өсуімен қайта түзілуіне әжептәуір әсер етеді. Өсімдіктер тінінің көпшілігі үшін температуралық қолайлылықты 23-26 ˚С құрайды. Ең алдымен, температуралық тәртіп өсімдіктер түріне тәуелді. Мысалы, тропикалық өсімдіктер үшін қолайлы температура 27˚С тақайды. Альпы тоғайларының өсімдіктері үшін 18-20˚С, басқа көптеген өсімдіктер үшін 25˚С болады. Клоналдық микрокөбейтуде пробиркалық өсімдіктерді климатикалық камераларда өсіреді, онда 16 сағаттық фотокезең және ауаның 70% ылғалдығы сақталады.

Әдетте өсімдіктердің оқшауланған жасушаларын аналық өсімдіктің жарық қарқыны және фотокезең талаптарын ескере отырып, люменесценттік лампалармен жарықтануында өсіріледі. Мурасиге өсімдіктердің клоналдық микрокөбейтуде бірінші және екінші кезеңдерде 1,5 мң лк және 14-16 сағаттық фотокезеңде күуді ұсынады, мұндай жарықтың жағдайлары өсімдіктердің көбіне өркендер мен тамырлардың инициациясына мүмкіндік береді. Жапырақтанудың жоғарылауы қарқынды өркен түзілуіне мүмкіндік жасайды.

В) клоналдық микрокөбейтуді қолдану

 Өсімдіктердің вегетативтік  көбеюінің жаңа келешегі бар  тәсілі болады, ол генетикалық  біртекті, сауыққан, егетін материалды  алуға, өсудің жоғары коэффициентіне  ие болуға, селекциялық үдерісті  қысқартуға, жыл бойына жұмыс  жасауға мүмкіндік береді, оның  үстіне өсімдіктерді өсіру үшін  керекті алаңды үнемдейді. Әдіс  жоғары сапалы егетін материалды  алуға көмектеседі., оны қолдану  егін шығымын әжептәуір көтереді  және оның сапасын жақсартады.

Клоналдық микрокөбейту декоративтік (орхидей, қалампыр, нарғызгүлдер, бақытгүлі, нәркестер, раушан, мамыргүл), көкөністік (картоп, томат, пияз, сарымсақ, орамжапырақтардың әртүрлері), жеміс-жидек (бүлдірген, таңқурай, қарақат, жүзім, алма, шие, аохоры, шабдалы) культурасын өсіру үшін қолданылады.

Дәнділердің ішінен мұндай әдіспен өндірістік масштабта тек қант қамысы мен бамбукты көбейтеді. Дәнді дақылдар in vitro жағдайында қиындықпен көбейеді және бұл әдіс аздаған көлемде селекциялық жұмыстарда пайдаланылады.

Дүние жүзінің көп елдерінде клоналдық микрокөбейтудің биоиндустриясы өндірістік негізде қойылған. Мысалы, Францияда гүлдік культураның барлық өнімінің 94% оқшауланған тіндер культурасының әдісімен алынады, АҚШ-та 100 коммерциялық өнеркәсіптер клоналдық микрокөбейтудің сәндік, көкөністік, далалық, жемістік және ормандық культуралардың егетін материалдарын алады. Гүлді өсімдіктердің саыққан, егетін материалдың басты өндірушісіне Голландия мен Италия жатады, олар алма ағашының, алхоры және шабдалы телітушілерінің бастылары болып келеді, ал қалампыр, бақытгүл, раушан, т.б. вируссыз егетін материалды көбейту мен алуды Ресей Федерациясының «элита» гүлдік шаруашылығында, меристемалық өндірісие «Кремзеленстрой» республикалық кешенде жүреді.