Соматическая гибридизация высших растений

План:

I.Введение………………………………………………………….......…...2

II. Основная часть

1. Соматическая гибридизация высших растений…...……4
2. Выделение протопластов…………………………………...6
3. Слияние протопластов……………………………………...9
4. Отбор и регенерация гибридных растений……………..11

 

III. Заключение……………………………………………………..……13

IV. Список литературы………..………………………………………..14

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Одно из направлений клеточных технологий – это использование их в селекции, которое облегчает и ускоряет традиционный селекционный процесс в создании новых форм и сортов растений. Существующие методы культивирования изолированных клеток и тканей in vitro условно можно разделить на две группы.

Первая группа – это вспомогательные технологии, которые не подменяют обычную селекцию, а служат ей. К ним можно отнести: оплодотворение in vitro (преодоление программной несовместимости), культивирование семяпочек и незрелых гибридных зародышей (преодоление постгамной несовместимости), получение гаплоидов путем культивирования пыльников и микроспор, криосохранение изолированных клеток, тканей и органов, клональное микроразмножение отдаленных гибридов.

Вторая группа методов ведет к самостоятельному, независимому от традиционных методов селекции, получению новых форм и сортов растений: клеточная селекция с использованием каллусной ткани, соматическая гибридизация (слияние изолированных протопластов и получение неполовых гибридов), применение методов генной инженерии.

Cоматическая гибридизация –создание неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток. Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрестить обычным половым путем, вызывать слияние трех и более родительских клеток, получать асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами или генами, или только органеллами и цитоплазмой другого. Гибридизация соматических клеток дает возможность не только соединить в одном ядре гены далеких видов растений, но и сочетать в гибридной клетке цитоплазматические гены партнеров.

Соматическая гибридизация осуществляется через посредство слияния оголенных (безоболочковых)  клеток,  получаемых  из  лизофильных клеток листа или каллусных тканей.

Соматическая гибридизация по сравнению  с  половой  имеет  свои преимущества, которые  заключаются в возможности скрещивания филогенетически отдаленных видов,  получение ассиметричных гибридов, несущих весь  генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами и цитоплазмой другого,  возможности слияния  трех  и  более клеток различных  родителей,  получении гетерозиготных по внеядерным генам.

Отличие соматической  гибридизации  от половой заключается и в принципиально ином наследовании ядерных и цитоплазматических  генов. В результате  слияния  протопластов можно получить после регенерации растения с двуродительскими внеядерными генами. С помощью соматической гибридизации получены гибриды между табаком и картофелем, дикими и культурными видами картофеля, морковью и петрушкой, томатом и картофелем. В результате слияния протопластов кочанной капусты и редьки осуществлен перенос ЦМС в капусту.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Соматическая гибридизация высших растений

Под соматической гибридизацией понимается гибридизация между протопластами, выделенными из соматических клеток растений. Обычно для соматической гибридизации используют протопласты , полученные из мезофильных клеток листа или каллусных тканей. Термин "соматическая гибридизация" впервые предложен Г.Мельхерсом (1974). Для обозначения соматического гибрида используют вместо формулы Ах В, принятой для записи половой гибридизации, формулы А+В или А (х) В. Для обозначения гибрида , несущего гены ядра только одного из родителей, наряду с цитоплазматическими ( внеядерными) генами от обоих или только от другого родителя , используют термин " цитоплазматический гибрид" ("цибрид"). Гибриды, несущие альтернативные цитоплазматические гены от обоих родителей, называют "цитоплазматическими гетерозиготами" ("цитогетами"). 
Первое слияние протопластов было получено Пауэром и др. в 1970 году.

Соматическая гибридизация растений включает четыре отдельных этапа: 
а)выделение протопластов 
б)слияние протопластов 
в) отбор и регенерация растений 
г) анализ растений – регенерантов 
Ю.Ю. Глеба, К.Н.Сытник (1982,1984) отмечают, что соматическая гибридизация открывает перед исследователем возможность: 
1) скрещивать филогенетически отдаленные виды растений ( организмов), которые невозможно скрестить половым путем; 
2) получить асимметричные гибриды, несущие весь генный набор одного из родителей наряду с несколькими хромосомами ( или несколькими генами, или только органеллами и цитоплазмой) другого; 
3) создать систему гибридизации, включающую одновременное слияние трех и более родительских клеток; 
4) получить растения, гетерозиготные по внеядерным генам( генам пластид и митохондрий) 
       Принципиальные различия между половыми и соматическими гибридами заключаются в следующем. При половой гибридизации происходит слияние ядер материнского и отцовского организмов и цитоплазмы материнского организма. При соматической гибридизации возможно слияние как ядер , так и цитоплазм материнского и отцовского организмов. При этом имеет место совершенно иной тип наследования ядерных и цитоплазматических генов. Ядерные гены при соматической гибридизации наследуются как дву, так однородительски, тогда как при половой только двуродительски. Внеядерные гены при соматической гибридизации наследуются двуродительски, а при половой передаются обычно только по материнской линии. 
В результате слияния протопластов можно получить после регенерации растения, создание которых невозможно половым путем: 
1)растения, ядро которых происходит от одного родителя, а цитоплазма от другого (цибриды); 
2)растения, гетерозиготные по внеядерным генам ( цитогеты): 
3)растения, часть внеядерных генов которых происходит от одного родителя, а часть от другого.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выделение протопластов. Изолированные протопласты представляют собой клетки, лишенные оболочки. Оболочка растительных клеток состоит главным образом из целлюлозы, гемицеллюлозы и пектиновых веществ. Для ее разрушения применяют ферментативные смеси на основе целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ. Впервые изолирование протопластов из клеток высших растений с использованием ферментов было осуществлено Е. Кокингом.

В настоящее время технология получения протопластов отработана для ряда культурных растений: табак, перец, баклажан, картофель, томаты, соя, клевер люцерна морковь, рапс и др.

Растительные протопласты способны восстанавливать клеточную оболочку, в результате делений образовывать каллус и в результате регенерации формировать растения. Благодаря этой способности протопласты нашли широкое применение в биотехнологии при гибридизации соматических клеток, переносе субклеточных частиц, клеточной селекции и генетической инженерии.

Отсутствие клеточной оболочки облегчает проникновение в протопласт из окружающего раствора макромолекул ( белки, нуклеиновые кислоты) и частиц (клеточные органеллы, микроорганизмы.).

Получение протопластов, таким образом, позволяет переходить с организменного уровня на клеточный и обратно, манипулировать содержанием растительной клетки, изменяя ее генетический аппарат.

Исходным материалом для выделения протопластов могут быть различные части растений листья, корни, семядоли, гипокотили, пыльцевые зерна, каллусные и суспензионные культуры. Оптимальные условия для выделения протопластов индивидуальны для различных растений и типов тканей. Главными факторами являются состав ферментов, рН среды, выбор осмотического раствора, физиологическое состояние, возраст и условия выращивания исходного растения. Вероятность получения жизнеспособных протопластов увеличивается, если растения находятся в состоянии активного роста. Эксплант растения подвергается стерилизации. Ферментные растворы лучше готовить непосредственно перед опытом или за сутки до опыта. Стерилизацию ферментов раствора производят через бактериальные фильтры. Важным фактором для выделения жизнеспособных протопластов является подбор осмотического стабилизатора, в качестве которого обычно используют сахара (глюкоза, сахароза, ксилоза, сорбит, маннит ); а также ионные осмотики – растворы солей СаСl2 , Na2 HPO4 , KCl. Среда должна быть гипертоничной, чтобы протопласты находились в слегка плазмолизированном состоянии.

Для получения протопластов из листьев их нарезают узкими полосами, после чего помещают на поверхность ферментного раствора в чашки Петри ( 1 г листовой ткани в 10 мл ферментного раствора ). Ферментацию листьев табака или картофеля проводят при 28-30 С в течение 15-18 часов. Ферментные смеси для мезофилла табака содержат 0,5 % целлюлазы, 0,5 % мацеразы, 0,2 % дриселазы. Для мезофилла листа картофеля используют смесь 1% целлулизина, 0,5 % мацеразы и 0,2 дриселазы. Ферментные смеси растворяют в растворе , содержащем 0,5 М сахарозы и 50 мМ СаСl2 при рН 5,5 – 5,6.

Для получения протопластов из суспензионной культуры ее предварительно осаждают центрифугированием или фильтрованием , затем переносят в ферментный раствор. Каллусные ткани, растущие на агаре , переносят в чашку с ферментным раствором с помощью скальпеля . В случае использования для получения протопластов каллуса и суспензионной культуры отпадает необходимость в стерилизации исходного материала. При использовании каллуса и суспензионной культуры лучшей является поздняя стадия логарифмического роста ( клеточные стенки легче разрушаются ферментами, протопласты наиболее жизнеспособны).

После обработки ферментным раствором и изоляции протопласты должны быть очищены от остатков ткани и отмыты от ферментов . Для этого содержимое чашки после инкубации в ферментном растворе фильтруют через воронку с нейлоновым фильтром в пустую колбочку. Затем полученную суспензию изолированных протопластов переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют. Подбирая растворы различной плотности , добиваются осаждения протопластов на дно пробирки или всплывания на поверхность раствора. Протопласты отбирают пипеткой и переносят в среду, содержащую осмотик, в которой их центрифугируют второй раз , отмывая от ферментного раствора. Отмывку обычно осуществляют дважды.

Для культивирования протопластов используют обычно метод платирования в агаре или метод жидких капель. Перед пересадкой протопласты промывают, суспендируют в определенном объеме среды для культивирования и подсчитывают количество клеток в образце с использованием камеры Фукса-Розенталя. Для определения жизнеспособности протопластов их окрашивают флуоресцеиндиацетатом (ФДА), после чего жизнеспособные протопласты узнают по зеленому свечению в ультрафиолетовом свете.

При платировании в агаре объем суспензии протопластов в жидкой питательной среде наливают в чашки Петри, добавляют равный объем той же среды, содержащей 1% агар-агара. Температура не должна превышать 45 оС Тщательно перемешивают и оставляют на 30 минут для застывания агара. Плотность культивирования протопластов 104-105/мл. Чашки Петри запечатывают парафилмом и хранят перевернутыми в термостатируемой комнате для культивирования. Протопласты фиксируются на крышке чашки Петри, что дает возможность наблюдать развитие каждого протопласта.

При культивировании в висячей/сидячей капле протопласты с помощью автоматической пипетки распределяют по маленьким каплям (20-40 мкл) на крышке или на дне чашки Петри. Чашки запечатывают парафилмом и хранят при высокой влажности.

Для культивирования протопластов используют обычно среды Мурасиге-Скуга (1962); Нагата, Такебе (1971); Као, Михайлюка (1978). Оптимальные условия культивирования протопластов видо- и сортоспецифичны. Как правило, для инициации деления протопластов света не требуется, однако некоторые из них обладают чувствительностью к свету. Температура в зависимости от культуры колеблется от 22 до 30 оС.

   

 

 

Протопласты табака (а) и томата (б) (Бричкова Г.Г., Богуш Н.А., Плюта А.В. Манешина Т.В., 2003)

 

 

Слияние протопластов. Методы выделения протопластов описаны нами ранее. Для слияния протопластов используют два основных подхода: 
   1. Использование полиэтиленгликоля (ПЭГ) в сочетании с высоким рН (9-11) среды и повышенным содержанием ионов кальция Са2+(100-300мМ). Полиэтиленгликоль выполняет роль индуктора слияния, который обеспечивает агглютинацию (слипание). Высокое значение рН и высокая концентрация ионов кальция необходимы для нейтрализации отрицательного поверхностного заряда, который имеют протопласты. В местах слипания происходит разрыв плазмалемм протопластов, приводящий к их слиянию. На этот процесс оказывают влияние, помимо внешних факторов, особенности тканевой принадлежности клеток. Легко сливаются меристемные и каллусные протопласты, менее эффективно сливаются сильно вакуолизированные клетки и клетки с развитыми хлоропластами ( например, мезофильные протопласты ) 
  2. Электрослияние протопластов. В этом случае протопласты помещают в неоднородное переменное электрическое поле. В этих условиях протопласты образуют мостик из нескольких клеток между электродами. После пропускания единичных импульсов тока происходит слияние протопластов в результате разрыва их плазмалемм. Эффективность метода слияния протопластов определяют по частоте слившихся протопластов, частоте клеточных клонов, образовавшихся из гибридных клеток, а также частоте образования гибридных проростков. В результате слияния протопластов образуются гомокарионы- продукты слияния генетически идентичных клеток, и гетерокарионы –продукты слияния генетически неидентичных клеток. Какова судьба слившихся протопластов? Возможны следующие варианты (Першина, 2000): 
- синхронное деление двух ядер без их слияния и образование в результате исходных делений двуядерных дочерних клеток; 
- слияние ядер во время митотического деления и формирование в дальнейшем одноядерных гибридных дочерних клеток. 
Стабильность ядерных и цитоплазматических носителей генетической информации зависит от степени филогенетического родства родителей. При филогенетической отдаленности в процессе последующего деления клеток может происходить элиминация хромосом одного из родителей с последующим однородительским наследованием генов. Степень элиминации может быть различной. При этом соматические гибриды, сохраняющие оба ядерных генома, называются симметрическими, а соматические гибриды, несущие хромосомы преимущественно одного родителя – асимметрическими. Элиминацию хромосом одного из видов можно индуцировать путем обработки протопластов этого вида радиацией или химическими агентами. Таким образом, при соматической гибридизации возникает источник генетической изменчивости в результате реконструкции ядерных геномов и переноса генов от одного родителя другому. 
         Так, в результате слияния протопластов культурного вида картофеля Solanum tuberosum и дикорастущего вида томата Lycopersiсon pimpinellifolium получены растения с реконструированным ядерным геномом картофеля и интрогрессией генов томата, контролирующих устойчивость к болезням. 
         Вторым источником генетической изменчивости при соматической гибридизации является сегрегация ( разделение между дочерними клетками) митохондрий и пластид, полученных от обоих родителей. Такая сегрегация происходит независимо от событий, происходящих в ядре, причем митохондрии сегрегируют независимо от пластид. Такое неменделевское расщепление по генам цитоплазмы обеспечивает варианты как однородительского, так и двуродительского их наследования и различные варианты сочетания органелл в цитоплазме дочерних клеток. Дополнительным источником изменчивости по цитоплазматическим генам является процесс рекомбинации генов митохондрий или пластид. Учитывая, что цитоплазматические гены во многом определяют продуктивность и устойчивость культурных растений, использование изменчивости по этим генам, создаваемой при соматической гибридизации – важный ресурс в селекции растений. 
       В целом следует отметить, что расширение возможного спектра изменчивости как по ядерным, так и по цитоплазматическим генам при соматической гибридизации в сравнении с половой, а также возможность вовлечения в гибридизацию филогенетически отдаленных видов создает перспективы для создания принципиально новых генотипов растений, несущих различные комбинации ядерных и цитоплазматических генов родителей.