Специальная микроскопия. Темнопольная микроскопия

 

Объектив - одна из важнейших частей микроскопа, поскольку он определяет полезное увеличение объекта. Объектив состоит из металлического цилиндра с вмонтированными в него линзами, число которых может быть различным. Увеличение объектива обозначено на нем цифрами. В учебных целях используют обычно объективы х8 и х40. Качество объектива определяет его разрешающая способность.

Окуляр устроен намного проще объектива. Он состоит из 2-3 линз, вмонтированных в металлический цилиндр. Между линзами расположена постоянная диафрагма, определяющая границы поля зрения. Нижняя линза фокусирует изображение объекта, построенное объективом в плоскости диафрагмы, а верхняя служит непосредственно для наблюдения. Увеличение окуляров обозначено на них цифрами: х7, х10, х15. Окуляры не выявляют новых деталей строения, и в этом отношении их увеличение бесполезно. Таким образом, окуляр, подобно лупе, дает прямое, мнимое, увеличенное изображение наблюдаемого объекта, построенное объективом.

Для определения общего увеличения микроскопа следует умножить увеличение объектива на увеличение окуляра.

Осветительное устройство состоит из зеркала или электроосветителя, конденсора с ирисовой диафрагмой и светофильтром, расположенных под предметным столиком. Они предназначены для освещения объекта пучком света.

Зеркало служит для направления света через конденсор и отверстие предметного столика на объект. Оно имеет две поверхности: плоскую и вогнутую. В лабораториях с рассеянным светом используют вогнутое зеркало.

Электроосветитель устанавливается под конденсором в гнездо подставки.

Конденсор состоит из 2-3 линз, вставленных в металлический цилиндр. При подъеме или опускании его с помощью специального винта соответственно конденсируется или рассеивается свет, падающий от зеркала на объект.

Ирисовая диафрагма расположена между зеркалом и конденсором. Она служит для изменения диаметра светового потока, направляемого зеркалом через конденсор на объект, в соответствии с диаметром фронтальной линзы объектива и состоит из тонких металлических пластинок. С помощью рычажка их можно то соединить, полностью закрывая нижнюю линзу конденсора, то развести, увеличивая поток света.

Кольцо с матовым стеклом или светофильтром уменьшает освещенность объекта. Оно расположено под диафрагмой и передвигается в горизонтальной плоскости.

Механическая система микроскопа состоит из подставки, коробки с микрометренным механизмом и микрометренным винтом, тубуса, тубусодержателя, винта грубой наводки, кронштейна конденсора, винта перемещения конденсора, револьвера, предметного столика.

Подставка - это основание микроскопа.

Коробка с микрометренным механизмом, построенном на принципе взаимодействующих шестерен, прикреплена к подставке неподвижно. Микрометренный винт служит для незначительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива на расстояния, измеряемые микрометрами. Полный оборот микрометренного винта передвигает тубусодержатель на 100 мкм, а поворот на одно деление опускает или поднимает тубусодержатель на 2 мкм. Во избежание порчи микрометренного механизма разрешается крутить микрометренный винт в одну сторону не более чем на половину оборота.

Тубус или трубка - цилиндр, в который сверху вставляют окуляры. Тубус подвижно соединен с головкой тубусодержателя, его фиксируют стопорным винтом в определенном положении. Ослабив стопорный винт, тубус можно снять.

Револьвер предназначен для быстрой смены объективов, которые ввинчиваются в его гнезда. Центрированное положение объектива обеспечивает защелка, расположенная внутри револьвера.

Тубусодержатель несет тубус и револьвер.

Винт грубой наводки используют для значительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива с целью фокусировки объекта при малом увеличении.

Предметный столик предназначен для расположения на нем препарата. В середине столика имеется круглое отверстие, в которое входит фронтальная линза конденсора. На столике имеются две пружинистые клеммы - зажимы, закрепляющие препарат.

Кронштейн конденсора подвижно присоединен к коробке микрометренного механизма. Его можно поднять или опустить при помощи винта, вращающего зубчатое колесо, входящее в пазы рейки с гребенчатой нарезкой.

3. Электронная микроскопия

 

Для изучения структуры  клеток на субклеточном и молекулярном уровнях, а также для изучения вирусов используют электронную  микроскопию. Ценность электронной микроскопии заключается в ее способности разрешать объекты, не разрешаемые оптическом микроскопом в видимом или ультрафиолетовом свете. Малая длина волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, позволяет разрешать, т.е. различать как отдельные объекты, отстоящие друг от друга всего на 2А (0,2 нм или 0,0002 мкм) или даже меньше, в то время как предел разрешения световой оптики лежит вблизи 0,2 мкм (он зависит от длины волны используемого света).

Электронная микроскопия, при которой изображение получают благодаря прохождению (просвечиванию) электронов через образец, называется просвечивающей (трансмиссивной). При сканирующей (растровой), или туннельной электронной микроскопии пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует изображение на светящемся экране микроскопа по аналогии с формированием телевизионного изображения.

Принципиальная оптическая схема электронного микроскопа аналогична схеме светового, в котором все оптическое элементы заменены соответствующими электрическими: источник света – источником электронов, стеклянные линзы – линзами электромагнитными. В электронных микроскопах просвечивающего типа различают три системы: электронно-оптическую, вакуумную и электропитания.

Источником электронов является электронная пушка, состоящая  из    V-образного вольфрамового термокатода, который при нагревании до 2900°С при подаче постоянного напряжения до 100 кВ в результате термоэмиссии испускает свободные электроны, ускоряемые затем электростатическим полем, создаваемым между фокусирующим электродом и анодом. Электронный пучок затем формируется с помощью конденсорных линз и направляется на исследуемый объект. Электроны, проходя сквозь объект, за счет его разной толщины и электроплотности отклоняются под различными углами и попадают в объективную линзу, которая формирует первое увеличение объекта.

После объективной линзы  электроны попадают в промежуточную  линзу, которая предназначена для плавного изменения увеличения микроскопа и получения дифракции с участков исследуемого образца. Проекционная линза создает конечное увеличенное изображение объекта, которое направляется на флуоресцентный экран. Благодаря взаимодействию быстрых электронов с люминофором экрана на нем возникает видимое изображение объекта. После наведения резкости сразу проводят фотографирование. Увеличение конечного изображения на экране определяется как произведение увеличений, даваемых объективной, промежуточной и проекционной линзами.

Электронномикроскопическому исследованию могут быть подвергнуты  как ультратонкие срезы различных  тканей, клеток, микроорганизмов, так и целые бактериальные клетки, вирусы, фаги, а также субклеточные культуры, выделяемые при разрушении клеток различными способами.

Виды электронных микроскопов:

1) Просвечивающий электронный  микроскоп (ПЭМ) — это установка, в которой изображение от ультратонкого объекта (толщиной порядка 0,1 мкм) формируется в результате взаимодействия пучка электронов с веществом образца с последующим увеличением магнитными линзами (объектив) и регистрацией на флуоресцентном экране. Для регистрации изображения возможно использование сенсоров, например, ПЗС-матрицы. Первый практический просвечивающий электронный микроскоп был построен Альбертом Пребусом и Дж. Хиллиером в университете Торонто (Канада) в 1938 году с использованием концепции, предложенной ранее Максом Кноллом и Эрнстом Руска.

 

2) Растровый электронный микроскоп (РЭМ, англ. Scanning Electron Microscope, SEM) — прибор, позволяющий получать изображения поверхности образца с большим разрешением (несколько нанометров). Ряд дополнительных методов позволяет получать информацию о химическом составе приповерхностных слоёв;

 

3) Сканирующий туннельный микроскоп (СТМ, англ. STM — scanning tunneling microscope) — прибор, предназначенный для измерения рельефа проводящих поверхностей с высоким пространственным разрешением. В СТМ острая металлическая игла подводится к образцу на расстояние нескольких ангстрем. При подаче на иглу относительно образца небольшого потенциала возникает туннельный ток. Величина этого тока экспоненциально зависит от расстояния образец-игла. Типичные значения 1-1000 пА при расстояниях около 1 Å.

 

Современные модели электронных  микроскопов устроены так, что сочетают в себе возможности как просвечивающего, так и сканирующего микроскопов, и их легко можно переоборудовать с одного типа на другой.

Просвечивающая электронная  микроскопия применяется для  изучения ультратонких срезов микробов, тканей, а также строения мелких объектов (вирусов, жгутиков и др.), контрастированных  фосфорно-вольфрамовой кислотой, уранилацетатом, напылением металлов в вакууме. Сканирующая электронная микроскопия применяется для изучения поверхности объектов. При просвечивающей электронной микроскопии получают плоскостные изображения объекта, а при сканирующей – удается получить трехмерное объемное изображение. В бактериологии сканирование наиболее эффективно для выявления отростков и других поверхностных структур, для определения формы и топографических отношений как в колониях, так и на поверхности инфицированных тканей.

При сканирующей микроскопии образец фиксируют, высушивают на холоде и напыляют в вакууме золотом или другими тяжелыми металлами. Таким образом получают реплику (отпечаток), повторяющую контуры образца, впоследствии сканируемую.

Недостатки электронного микроскопа:  
1) подготовленный к исследованию материал должен быть мертвым, так как в процессе наблюдения он находится в вакууме;

 
2) трудно быть уверенным, что  объект воспроизводит живую клетку  во всех ее деталях, поскольку  фиксация и окрашивание исследуемого  материала могут изменить или повредить ее структуру;

 
3) дорого стоит и сам электронный  микроскоп и его обслуживание;

 
4) подготовка материала для работы  с микроскопом отнимает много  времени и требует высокой  квалификации персонала; 

 
5) исследуемые образцы под действием  пучка электронов постепенно разрушаются. Поэтому, если требуется детальное изучение образца, необходимо его фотографировать.

3.1. История создания электронного микроскопа

 

Появление электронного микроскопа стало возможным после  ряда физических открытий конца XIX — начала XX века. Это открытие в 1897 году электрона (Дж. Томсон) и экспериментальное обнаружение в 1926 году волновых свойств электрона (К. Дэвиссон, Л. Гермер), подтверждающее выдвинутую в 1924 году де Бройлем гипотезу о корпускулярно-волновом дуализме всех видов материи. В 1926 году немецкий физик X. Буш создал магнитную линзу, позволяющую фокусировать электронные лучи, что послужило предпосылкой для создания в 1930-х годах первого электронного микроскопа.

В 1931 году Р. Руденберг  получил патент на просвечивающий электронный микроскоп, а в 1932 году М. Кнолль и Э. Руска построили первый прототип современного прибора. Эта работа Э. Руски в 1986 году была отмечена Нобелевской премией по физике. Использование просвечивающего электронного микроскопа для научных исследований было начато в конце 1930-ых годов и тогда же появился первый коммерческий прибор, построенный фирмой Siemens.

В конце 1930-ых — начале 1940-ых годов появились первые растровые  электронные микроскопы, формирующие изображение объекта при последовательном перемещении электронного зонда малого сечения по объекту. Массовое применение этих приборов в научных исследованиях началось в 1960-ых годах, когда они достигли значительного технического совершенства.

 

Заключение

Современная диагностика  сканирования капли крови на темнопольном микроскопе позволяет определить состояние эритроцитов, их подвижность в плазме, агрегация и сладж. Анализируя состояние тромбоцитов, лимфоцитов и лейкоцитов, можно определить активность иммунной системы и способность организма к самовосстановлению, а также патологические изменения состава крови, приводящие к развитию многих заболеваний.

На основе такого анализа  клеток крови и плазмы, определяются различные, уже существующие отклонения здоровья и предрасположенность к возникновению новых. Спектр диагностики заболеваний очень широкий.

Анализ капли крови  на темнопольном микроскопе позволяет  выявить наличие кристаллов холестерина, сахара, мочевой кислоты и др., включая дрожжевую и бактериальную инфекцию.

На основании сканирования крови на темнопольном микроскопе составляется индивидуальная программа оздоровления. Сканирование крови на темнопольном микроскопе является альтернативным и  эксклюзивным методом диагностики  здоровья.

Современные электронные микроскопы, выпускаемые в промышленности, имеют достаточно большие размеры (примерно размером с рабочий стол), но уже некоторые компании выпускают портативные электронные микроскопы, которые устанавливаются на рабочем столе.

 

Литература

1. Воробьев А.А., Быков А.С. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии – М.: Медицинское информационное агентство, 2003. - 236 с.

2. Воробьев А.А. Медицинская  и санитарная микробиология –  М.: Издательский центр «Академия», 2003. – 464 с.

3. Королюк А.М., Сбойчаков В.Б. Медицинская микробиология. Часть первая. – СПб., 1999. – 272 с.

4. Коротяев А.И., Бабичев  С.А. Медицинская микробиология,  иммунология и вирусология –  СПб.: «Специальная литература», 1998. – 592 с.