Строение белков

Лекция 4

 

СТРОЕНИЕ БЕЛКОВ

В строении белков различают четыре уровня организации молекулы: первичную, вторичную, третичную и четвертичную структуры. Первые два уровня характерны для всех белков. Третичная и четвертичная структуры имеют место только у глобулярных белков.

Первичная структура белков

Образование пептидной связи

Первичная структура белков - это последовательность остатков аминокислот в полипептидной цепи. Порядок аминокислот в белке предопределен генетически последовательностью нуклеотидов в ДНК. Полипептид образуется путем взаимодействия карбоксильной группы одной аминокислоты с аминогруппой другой аминокислоты - пептидная связь.

"Голова" (NH2-) одной аминокислоты присоединяется к "хвосту" (-СООН) другой аминокислоты. Между аминокислотами замыкается пептидная связь (-CO-NH-), являющаяся единственным типом связи в первичной структуре белка. Как видно из приведенной схемы, при образовании пептидной связи высвобождается вода. Разрыв пептидной связи при гидролизе  сопровождается присоединением воды по месту расщепляемой связи. Конечный продукт гидролиза белков и полипептидов - свободные аминокислоты.

Пептидная связь прочнее одинарных связей между углеродом и азотом, так как в результате таутомерии на 40% является двойной. По той же причине в полипептидной цепи вращение возможно только вокруг углеродных атомов, связанных с радикалом

Скелет у всех полипептидов одинаковый. Различаются полипептидные цепи характером и последовательностью радикалов. Называют полипептид по числу составляющих его остатков аминокислот: дипептидом, трипептидом и т.д.

Белками называют полипептиды, содержащие более 50 остатков аминокислот. Простейший белок - инсулин. Он содержит всего 51 остаток аминокислот. Рибонуклеаза включает 124 остатка, гемоглобин 574.

В белках последовательность аминокислот, т.е. первичная структура, строго определенная. Замена остатка одной аминокислоты на другую дает уже новый белок. Так, в инсулине быка в девятом положении находится остаток серина, а в инсулине барана - глицина. В инсулине человека и лошади различия касаются трех остатков аминокислот - восьмого, девятого и десятого. Все перечисленные инсулины имеют различную первичную структуру. Белки разных организмов с одинаковой функцией называются гомологичными.

 

Вторичная структура белков

Различают два основных типа вторичной структуры белков: спираль и складчатый слой.

β-складчатый слой	α-спираль

Спирали. Благодаря свободному вращению связей вокруг α-углеродного атома в полипептидной цепи, нарушается линейность полипептидной цепи. Это приводит к образованию спиралей. Существует 3 разновидности спиралей.

1. Для кератина характерна α-спираль. Полипептидная цепь кератина как бы накручена на воображаемый цилиндр. Витки друг возле друга удерживаются водородными связями между кислородом одной пептидной связи и водородом другой пептидной связи. Водородные связи в 20 раз слабее ковалентных связей между кислородом и водородом, но благодаря их многочисленности они довольно прочно, удерживают спираль.

2. β-спираль обнаружена в белке бактерий. Один виток р-спирали состоит из 22 остатков аминокислот, β-спираль - полая труба, α-спираль - заполненный цилиндр.

3. Ломаная спираль характерна для коллагена. Такая разновидность спирали является следствием высокого содержания в коллагене глицина и пролина с гидроксипролином - аминокислот, нарушающих "правильность" спирали.

 

Складчатый слой характерен для белка шелка - фиброина. Направление рядом лежащих цепей в складчатом слое противоположное (антипараллельны) Друг возле друга цепи удерживаются водородными связями.

Спирали и складчатые слои в фибриллярных белках часто дают сверх-вторичные структуры или суперспирали. Так, 7 α-спиралей кератина дают суперспираль. В свою очередь, 11 суперспиралей кератина образуют микрофибриллу волоса.

Вторичная структура глобулярных белков не столь однообразна как у фибриллярных белков. Так, в молекуле миоглобина спирализовано 77% полипептидной цепи и 23% не спирализовано. Степень спирализации инсулина - 60%, яичного альбумина - 40%, пепсина - 28%. Полипептидная цепь химотрипсина почти не содержит спирализованных участков, однако здесь есть складчатые, слои, петли, изгибы и т.д.

В структуре глобулярных белков с молекулярной массой свыше 20 тыс. Да различают понятие домен - небольшие участки в 100-150 остатков аминокислот с характерной структурой. Их называют структурными доменами.

Между доменами и отдельными структурными элементами внутри домена имеются так называемые шарнирные участки. Часто в одном белке обнаруживается несколько похожих однотипных доменов.

Существует еще понятие функциональный домен. В последнем случае один или несколько структурных доменов вместе образуют функционально обособленный участок в молекуле белка: субстратную площадку, окружение активного центра фермента или ингибитора, ионный канал в мембране и др.

 

Третичная структура - расположение полипептидной цепи (спирализованной, малоспирализованной или неспирализованной) в трехмерном пространстве.

Несмотря на кажущуюся беспорядочность глобулярного клубка, его строение строго определенное и имеет некоторые закономерности.

1. Полипептидные цепи в глобуле упакованы очень плотно.
2. Обычно полярные группы белка находятся на поверхности глобулы, а гидрофобные радикалы спрятаны внутри нее.

Третичная структура белков удерживается следующими силами (см. рисунок):

а) дисульфидными мостиками, образующимися между остатками цистеина, расположенных на удаленных участках полипептидной цепи;

б) электростатическим притяжением между противоположно заряженными ионизированными группами (ионными связями);

в, г) водородными связями между пептидными связями, между гидроксильными и карбоксильными группами и др.;

д) ван-дер-ваальсовыми силами (например, гидрофобным взаимодействием между радикалами гидрофобных (неполярных) аминокислот);

Все перечисленные силы слабые, но в комплексе способны удержать полипептидную цепь в уникальной конформации. Вместе с тем, благодаря непрочности этих связей, становятся возможными конформационные изменения в молекуле белка, необходимые для его функционирования. Непрочность позволяет белку изменять структуру в зависимости от условий окружающей среды.

 

Четвертичная структура определяется количеством полипептидных цепей в молекуле белка. Не все белки имеют этот уровень структуры, а только олигомерные, в которых 2 и более полипептидных цепи. Отдельные цепи со своей вторичной и третичной структурой называются протомерами олигомерного белка. Так, молекула гемоглобина состоит из 4 полипептидных цепей (протомеров). Четвертичная структура олигомерных белков удерживается теми же силами, что и третичная структура, с той лишь разницей, что они объединяют разные полипептидные цепи.

 

Свойства белков

Растворимость белков

Белки обладают различной растворимостью в воде (смотри классификацию белков). Будучи коллоидно-дисперсными системами, растворы белков менее устойчивы по сравнению с истинными растворами солей и других веществ. Молекулы белка в растворах склонны к агрегации и седиментации. Гидратная оболочка повышает устойчивость белков в растворах. Эта оболочка образуется вследствие гидратации отдельных гидрофильных групп белка: карбоксильной, аминной, гидроксильной, тиоловой и пептидной связи. У глобулярных белков эти группы находятся на поверхности глобулы. Гидратная оболочка препятствует объединению (агрегации) молекул белка и, следовательно, разъединяет их.

Другой фактор устойчивости белка - заряд. В растворе при определенных условиях все молекулы данного белка имеют одинаковый по знаку и количеству заряд. Благодаря этому молекулы электростатически отталкиваются друг от друга, не объединяются и не выпадают в осадок.

Лишение белка одного из факторов устойчивости часто приводит к выпадению белка из раствора в осадок. Так, при добавлении к раствору белка достаточного количества солей щелочных и щелочноземельных металлов, спирта или ацетона белок выпадает в осадок. Это осаждение называется высаливанием. Механизм высаливания заключается в том, что ионы солей и молекулы спирта и ацетона, имея мощную собственную гидратную оболочку, отнимают воду у молекулы белка. Разные белки высаливаются при разной концентрации солей. Глобулины высаливаются в полунасыщенном растворе сульфата аммония, а альбумины только в насыщенном растворе этой соли. Фракционное высаливание используется для разделения и очистки белков.

Некоторые белки выпадают в осадок при рН, соответствующем изоэлектрической точке. Так, казеин осаждается при рН 4,7, поскольку при этом значении рН молекулы не имеют заряда и быстро агрегируются в крупные, неустойчивые в растворе частицы. Другие белки более устойчивы, и для их осаждения необходимо воздействие на оба фактора устойчивости белков.

Диализ белков

Диализ. Черные кружки - молекулы белка, белые кружки - молекулы хлористого натрия

Благодаря крупным размерам, молекулы белка не проникают через некоторые пленки; целлофан, рыбий пузырь и др. Это свойство используется для очистки белков от низкомолекулярных примесей, т.е. для диализа.

В целлофановый мешок наливается раствор белка с примесью солей, мешок помещается в сосуд, через который протекает дистиллированная вода. Мелкие ионы солей и др. вещества проникают через целлофан в воду и удаляются, а раствор белка остается в мешке.

 

 

 

Заряд белка

В составе белка, как правило, сумма кислых, отрицательно заряженных аминокислот (глутаминовой, аспарагиновой) не равняется сумме основных, положительно заряженных аминокислот (лизина, аргинина, гистидина). В силу этого белки в воде имеют заряд либо положительный, либо отрицательный. При подкислении раствора такого белка, (в избытке Н+), будет подавляться ионизация карбоксильных групп и наступает такой момент, когда сумма положительно заряженных групп будет равна сумме отрицательно заряженных. В этом случае молекула белка в целом не имеет заряда. Такое состояние белка называется изоэлектрическим, а рН, при котором наступает изоэлектрическое состояние, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). ИЭТ - одна из важнейших характеристик белка.

При дальнейшем подкислении раствора белок становится положительно заряженным. Происходит перезарядка молекул белка. Если же взять положительно заряженный белок, то при подщелачивании он приобретает вначале изоэлектрическое состояние, а затем становится заряженным отрицательно.

Общее правило такое: белок при рН ниже ИЭТ заряжен положительно и является катионом, а при рН выше ИЭТ заряжен отрицательно и является анионом.

Различие в заряде белков позволяет разделить их в постоянном электрическом поле. Этот метод разделения называется электрофорезом.

В основе ионообменной хроматографии также лежит различие в заряде разделяемых веществ смеси.

Денатурация белков

Денатурацией называется любое негидролитическое изменение структуры белков, сопровождающееся изменением их биологической активности и функции. Денатурацию могут вызвать многие факторы: кипячение, высокая температура, ультрафиолетовое и ионизирующие излучение, избыточное давление, соли тяжелых металлов, экстремальные значения рН (крепкие кислоты и щелочи), некоторые органические соединения.

Нагревание и различного вида излучения разрушают в белке водородные и ионные связи. Сильные кислоты, щелочи и концентрированные растворы солей разрывают ионные связи. Тяжелые металлы дают прочные связи с карбоксианионами и разрывают ионые связи. Органические растворители и детергенты нарушают гидрофобные взаимодействия и разрывают водородные связи в белках.

При денатурации изменяются или разрушаются все слабые связи в белке: водородные, электростатические, гидрофобные и т.д., но остаются нетронутыми пептидные связи.

Признаками денатурации являются:

1. изменение растворимости. Растворенный в воде белок выпадает в осадок или, наоборот, нерастворимый белок переходит в раствор;
2. изменение оптической активности, например, угла вращения плоскости поляризованного луча;
3. появление новых реакционноспособных групп, спрятанных до денатурации внутри белковой глобулы;
4. главный и первый признак денатурации - потеря функции. Структурный белок становится рыхлым, ферменты теряют каталитическую активность и т.д.

После освобождения от денатурирующего агента белок постепенно приобретает свои первоначальные свойства. Этот процесс называется  ренатурацией.

Оптические свойства белков

За исключением хромопротеинов белки не имеют окраски. Белки поглощают ультрафиолетовый свет с максимумом при λ=280 нм за счет ароматических аминокислот. Второй максимум поглощения при λ=216 нм принадлежит пептидной связи.