Строение вируса иммунодефицита человека и его жизненный цикл

1. Строение вируса иммунодефицита человека и его жизненный цикл.

ВИЧ относится к семейству ретровирусов, его геном состоит из двух идентичных копий одноцепочечной РНК (рис. 1). Вирус имеет специальный фермент - обратную транскриптазу (RT - Reverse Transcriptase), также именуемую ревертазой. Это многофункциональный фермент, состоящий из двух субъединиц с несколькими доменами и обладающий активностью как РНК-, так и ДНК-зависимой ДНК-полимеразы, а также РНКазы Н. Ревертаза после проникновения вируса в клетку-мишень синтезирует цепь ДНК на матрице вирусной РНК, т.е. этот фермент действует как РНК-зависимая ДНК-полимераза. Затем РНКаза Н разрушает матричную РНК в гибриде РНК-ДНК. После чего обратная транскриптаза синтезирует комплементарную цепь ДНК, в конечном результате формируя двухцепочечную ДНК.

Другой вирусный фермент - интеграза - катализирует ковалентную интеграцию вирусной ДНК в ДНК генома человека, причём сразу в несколько разных участков. Интегрированная ДНК вируса называется провирусом. С этой ДНК происходят транскрипция мРНК для трансляции белков вируса и синтез геномной РНК вируса.

Фосфолипидная оболочка ВИЧ - это часть мембраны клетки человека, захваченная при отпочковывании вирусной частицы от неё. В оболочку ВИЧ встроены гликопротеины (gp - glycoprotein) gp120 (поверхностный) и gp41 (трансмембранный). Каждый из них состоит из трёх субъединиц.

Рис. 1. Строение вируса иммунодефицита человека. Оболочка вируса - фосфолипидная мембрана, в которую встроены гликопротеины gp120 (поверхностный) и gp41 (трансмембранный). В нуклеокапсиде заключён геном вируса - две одноцепочечные нити РНК. В матриксе представлен белок p17, в оболочке нуклеокапсида - белок p24. Ферменты вируса иммунодефицита человека: обратная транскриптаза, интеграза и протеаза

Геном ВИЧ состоит приблизительно из 10 000 нуклеотидов, частота точечных мутаций составляет около 10-4, т.е. каждый дочерний вирион несёт хотя бы одну мутацию. Столь высокая генетическая изменчивость характерна для РНК-содержащих вирусов и объясняется высокой частотой ошибок при «работе» обратной транскриптазы. Ретровирусы по совокупности своих патогенных свойств превосходят другие вирусы. Подсчитано, что в организме инфицированного больного на бессимптомной стадии развития болезни содержится до 106 генетических вариантов вируса (квази-видов), на стадии клинических проявлений - около 108 вариантов. Цикл репликации вируса продолжается 10 ч. Вирус цитопатогенен, т.е. после выхода вирионов из клетки последняя разрушается.

Оба конца генома ВИЧ (3' и 5') представлены длинными концевыми повторами LTR (Long Terminal Repeats),синтезируемыми в процессе интеграции ДНК провируса в геном клетки. LTR управляют образованием новых вирусов и могут активироваться и белками вируса, и белками инфицированной клетки.

В геноме ВИЧ 9 генов, расположенных «внахлёст», т.е. перекрывающихся друг с другом. Эти 9 генов кодируют по меньшей мере 15 белков. Гены gag, pol и env кодируют структурные белки вируса. Ген pol (polymerase) кодирует ферменты: обратную транскриптазу, интегразу и протеазу. Ген gag (group specific antigens) кодирует полипротеин, расщепляемый протеазой до p6, p7, p17, p24. Ген env (envelope) кодирует белок gp160, расщепляемый протеазой на gp41 и gp120. Другие 6 генов - tat (transactivator of transcription), rev (regulator of virus), nef (negative factor), vif (viral infectivity factor), vpr (virus protein R), vpu (virus protein U, только в ВИЧ-1), vpx (virus protein X, только в ВИЧ-2) - кодируют регуляторные белки (их чаще всего обозначают по названию гена теми же 3 буквами, только первая буква заглавная), отвечающие за способность ВИЧ инфицировать клетки и производить новые копии вируса.

Белки ВИЧ. Основные белки ВИЧ-1 (лат. буква «p» означает «protein», а цифры после «p» - молекулярный вес в кДа):

◊ gp120 - поверхностный белок, обеспечивает связывание с клетками-мишенями; лиганды: молекула CD4, рецептор для хемокинов семейств CC и CXC;

◊ gp41 - обеспечивает слияние мембран клетки и вириона и интернализацию вириона в клетку;

◊ p24 - формирует оболочку нуклеокапсида (ядра вируса);

◊ p17 - белок матрикса вируса, связан с фосфолипидной мембраной, взаимодействует с gp41 и gp120; участвует в транспорте содержимого нуклеокапсида;

◊ p7 - белок нуклеокапсида, связан с геномной РНК;

◊ p6 - связывается с белком Vpr;

◊ p66/51 - обратная транскриптаза (RT, ревертаза, РНК-зависимая ДНК-полимераза), синтезирует ДНК на матрице

РНК;

◊ p15 - домен обратной транскриптазы с активностью РНКазы H, удаляет РНК из гибрида РНК-ДНК;

◊ p31 - интеграза, встраивает ДНК вируса в клеточный геном;

◊ p10-15 - протеаза; расщепляет большие белковые трансляты на отдельные функционально активные белки вируса;

◊ Tat (p14-16) - активирует транскрипцию с вирусных генов, стабилизирует вирусную мРНК, усиливает трансляцию с вирусной мРНК;

◊ Rev (p19) - нужен для экспрессии белков оболочки; а также обеспечивает транспорт компонентов вируса из ядра;

◊ Nef (p25-27) - способствует усилению инфицирующей способности вирионов, уменьшает количество рецептора CD4 на поверхности инфицированных клеток и приводит к эндоцитозу молекул MHC-I;

◊ Vif (p23) - необходим для выхода реплицировавших вирусов из клетки-мишени (вероятно, участвует в фолдинге белков оболочки);

◊ Vpr (p10-15) - способствует репликации ВИЧ в неделящихся и дифференцированных клетках, например макрофагах, нейронах, ДК;

◊ Vpu (p15) - стимулирует отпочковывание вируса; этот белок необязателен для жизненного цикла ВИЧ.

Заражение клетки. ВИЧ преимущественно инфицирует CD4+ T-лимфоциты, а также ДК (главный резервуар латентной инфекции), моноциты/макрофаги и клетки микроглии мозга. Для внедрения в клетку человека ВИЧ использует её мембранные рецепторы CD4, а также рецепторы для хемокинов семейств CC (RANTES, MIP-1a, MIP-1p) и CXC (SDF-1) - CCR5 (моноциты/макрофаги) и CXCR4 (CD4+ T-лимфоциты). У инфицированного человека вирус присутствует во всех тканях и секретах организма, включая сперму, слизистые секреты, а также в небольших количествах в слюне, поте, ушной сере, моче, экскрементах (этих незначительных концентраций недостаточно для передачи инфекции).

Пути трансмиссии ВИЧ: половой, через слизистые оболочки, повреждённую кожу, трансфузионно (переливание крови и введение препаратов из заражённой крови), через общие шприцы наркоманов, трансплацентарно, через грудное молоко.

Антропогенные факторы пандемии: наркомания, широкое применение гемотрансфузий и продуктов из человеческой крови; медицинский инструментарий для манипуляций на слизистых оболочках (эндоскопы, стоматологическое оборудование и др.); массовый трансконтинентальный транспорт; высокая концентрация населения в больших городах; полигамные сексуальные контакты.

 

Жизненный цикл ВИЧ состоит из нескольких событий.

• Свободный вирус приближается к клетке человека (Т-лимфоциту, ДК, моноциту/макрофагу и др.).

• Белок вирусной оболочки gp120 взаимодействует с мембранными рецепторами CD4 и CXCR4 (если вместо лимфоцита моноцит/макрофаг, то gp120 связывается с CD4 и CCR5).

• Вирусный трансмембранный гликопротеин gp41 заякоривается в мембране клетки-мишени и обеспечивает её слияние с оболочкой вируса. Содержимое вируса впрыскивается в клетку.

• Обратная транскрипция. Одноцепочечная вирусная РНК служит матрицей, на которой вирусная ревертаза синтезирует ДНК. Получается гибрид РНК-ДНК, потом РНК удаляется из гибрида вирусной РНКазой Н, после чего достраивается комплементарная цепь ДНК и образуется двойная спираль.

• Интеграция в геном клетки. Вирусная ДНК встраивается в человеческую ДНК с помощью вирусной интегразы. Когда инфицированная клетка делится, то копия встроенной вирусной ДНК (провирус) передаётся дочерней клетке, т.е. провирус размножается одновременно с клеткой.

• Транскрипция. На ДНК провируса синтезируется РНК, которая одновременно служит и структурной основой для постройки генома вирусных частиц, и матрицей для синтеза белков вируса.

• Трансляция. На вирусной матричной РНК синтезируются вирусные белки.

• Сборка. Вирусные РНК и белки собираются в незрелую вирусную частицу.

• Отпочковывание. Незрелые вирусные частицы отпочковываются от клетки, забирая себе часть клеточной фосфолипидной мембраны. Вирусная протеаза начинает расщеплять вирусные трансляты.

• Созревание. Вирусная протеаза расщепляет вирусные трансляты на функционально активные вирусные белки, и образуется вирус, полностью готовый к заражению новой клетки. Активное размножение ВИЧ происходит в CD4+ Т-хелперах. В других заражённых клетках ВИЧ сохраняется, воспроизводится с клеткой и нарушает её функции (см. раздел «Проявления иммунодепрессии»).

Жизненный цикл ВИЧ представлен на рис. 2.

Рис. 2. Жизненный цикл вируса иммунодефицита человека. Взаимодействие вируса с CD4+ Т-лимфоцитом, встраивание вирусного генома в геном человека и размножение вируса.

 

 

2. Ферменты генной  инженерии

Ферменты генетической инженерии – это ферменты, позволяющие проводить различные манипуляции с молекулами ДНК: разрезать в определенных местах, соединять различные по происхождению фрагменты, синтезировать новые, не существующие в природе последовательности, и т.д. Рассмотрим основные ферменты генетической инженерии.

ДНК-полимеразы. Одним из наиболее часто используемых в генетической инженерии ферментов является ДНК-полимераза I, выделенная из E.coli или фага Т4. ДНК-полимераза Ī обладает способностью удлинять цепь ДНК в направлении 5→3 путем присоединения комплементарного нуклеотида. Это свойство ДНК-полимераз используется в генной инженерии для построения второй комплементарной цепи: при добавлении фермента к одноцепочной ДНК-матрице в присутствии праймера произойдет ее удвоение. Это свойство используется, например, при создании Кднк-библиотек. ДНК-полимераза применяется также для заполнения «бреши» в цепи ДНК, например, при застраивании фрагментов с выступающими 5 концами. экзонуклеазная активность ДНК-полимераз используется для введения радиоактивной метки во фрагмент ДНК.

Использование специфических термостабильных ДНК-полимераз – Tth- и Taq- полимераз – выделенных из бактерий, живущих в гейзерах, позволило проводить амплификацию – множественную наработку любого фрагмента ДНК методомполимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод ПЦР, в основу которого положена Taq- полимераза, не только упростил некоторые старые методики генной инженерии, но и позволил проводить молекулярное маркирование как отдельных генов, так и целых геномов.

Из некоторых вирусов была выделена специфическая ДНК-полимераза – РНК-зависимая ДНК-полимераза, названная обратнгой транскриптазой, или ревертазой. Ревертазы могут синтезировать комплементарную цепь ДНК на РНК-матрице. С помощью ревертаз можно получать кДНК-ДНК-копии мРНК. кДНК  позволяют изучать строение генов и идентифицировать полноценные копии этих генов в геноме.

ДНК-лигаза осуществляет одну функцию – соединение фрагментов ДНК путем восстановления фосфодиэфирных связей между соединениями нуклеотидами. Этот процесс называется лигированием. Наиболее часто для лигирования в генной инженерии используют ДНК-лигазу фага Т4. с помощью лигазы Т4 соединяют любые фрагменты ДНК с любыми концами: «липкими» или «тупыми». Это один из наиболее часто использующихся ферментов.

Нуклеазы –это большая группа ферментов, катализирующих реакцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот. В результате действия нуклеаз молекула ДНК или РНК распадается на фрагменты или отдельные нуклеотиды. Исходная функция нуклеаз в клетке – деградация ненужных в данный момент жизнедеятельности молекул (например, деградация мРНК после трансляции) и защита от чужеродных молекул нуклеиновых кислот (расщепление фаговой ДНК бактериальными нуклеазами при заражении бактерии фагом).

Нуклеазы по типу их действия можно поделить на группы. Нуклеазы могут  действовать только на молекулы и ДНК, и РНК одновременно (нуклеаза золотистой фасоли). Нуклеазы избирательно могут действовать на одноцепочечную (нуклеаза S1), или двуцепочечную  (экзонуклеаза III) молекулы ДНК, или на гибридную ДНК – РНК-молекулу (рибонуклеаза Н).

Кроме того, нуклеазы можно разделить на два типа: на экзонуклеазы и эндонуклеазы .  Экзонуклеазы обычно гидролизуют молекулы с 5 ́- или 3 ́- свободных концов, а эндонуклеазы могут расщеплять внутри последовательности фрагмента или кольцевой молекулы ДНК.

Рестриктазы. Отдельную группу, особенно с утилитарной точки зрения ее применения в генной инжененрии, представляют специфические эндонуклеазы – рестриктазы.

В основе метода, позволившего непосредственно приступить к манипуляциям с генами, лежит открытие ферментов, названных рестрикционными эндонуклеазами (рестриктазами). Еще в 1953г. было обнаружено, что ДНК определенного штамма E. Coli, введенная в клетки другого штамма (например, ДНК штамма В в клетки штамма С), не проявляет, как правило, генетической активности, так как быстро расщепляется на фрагменты ДНК-специфическими ферментами – рестриктазами. К настоящему времени из разных микроорганизмов выделено более тысячи различных рестриктаз. В генетической инженерии наиболее широко используются коло 200.

Рестриктазы предщставляют собой особый класс эндонуклеаз, которые гидролизуют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, называются сайтами рестрикции.каждая из рестриктаз узнает свой свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри последовательности сайта рестрикции, либо в непосредственной близости от него. Таким образом, при действии конкретной рестриктазы одна и та же последовательность ДНК будет всегда образовывать одинаковый набор фрагментов. Обозначение рестриктаз складывается из начальных букв латинского названия вида бактерий, из которого был выделен фермент, и дополнительного обозначения, так как из бактерий одного вида может быть выделено несколько различных рестриктаз: