Стволовые клетки

1. Стволовые клетки  взрослого организма:  
В течение жизни во взрослом организме постоянно происходит гибель клеток различных тканей, как при естественном обновлении (апоптоз), так и при повреждениях (некроз). Восстановление утраченных клеток происходит за счет камбиальных элементов. В кишечнике, коже, мышцах, красном костном мозге, печени, головном мозге существуют пролиферирующие тканеспецифические популяции клеток.  
В последние годы в тканях сформировавшегося организма были выявлены клеточные элементы, способные к дифференцировке не только в тканеспецифических направлениях, но и в клетки иного тканевого происхождения. При этом происходит потеря первичных тканевых маркеров и функций и приобретение маркеров и функций вновь образованного клеточного типа. Это явление получило название трансдифференцировки или пластичности. Подобные клеточные элементы классифицируют как мультипотентные стволовые клетки взрослого организма. Ещё одно их свойство – способность к миграции в другие ткани in vivo.  
Открытие стволовых клеток взрослого организма позволяет по-новому подойти к проблеме обновления сформировавшихся тканей, изменить концепцию клеточной и генной терапии различных заболеваний. Изучение свойств стволовых клеток и их влияния на репаративные процессы в организме - одна из наиболее актуальных задач современной клеточной биологии. Особая значимость исследований в данной области связана с применением клеточных технологий для лечения человека.  
К настоящему моменту выделены следующие типы стволовых клеток взрослого организма: гемопоэтические, мышечные, нервной ткани, кожи, эндотелия, кишечника, миокарда, гемопоэтические и мезенхимные стволовые клетки.

 
ГЕМОПОЭТИЧЕСКИЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ (ГСК)  
Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) - популяция мультипотентных стволовых клеток - в настоящее время охарактеризована наиболее полно. ГСК находятся в красном костном мозге взрослого организма. Впервые популяция ГСК была выделена из костного мозга (КМ) мыши около 30 лет назад. Клоногенные свойства этих клеток, доказанные позднее в экспериментах in vivo и in vitro, позволили выделять данные клетки с высоким уровнем чистоты (~85 %-95 %). Фенотипическим "портретом" чистых популяций ГСК считается присутствие на поверхности клетки маркеров CD34, CD133,

c-kit (CD117), и отсутствие CD38, и специфических маркеров коммитированных клеток крови: гликофорина A, CD2,CD3, CD4, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD56 и CD66b (Lin-). Долгое время считалось, что ГСК способны дифференцироваться только в клетки крови. Однако исследования по выявлению мультипотентности ГСК, выполненные в последние годы, показали, что при трансплантации в кровоток ГСК могут дифференцироваться также в гепатоциты, клетки эпителия и эндотелий.  
 
На основании экспериментальных работ, выполненных в течение последних лет, ГСК можно считать агентами клеточной терапии только при повреждениях печени и сосудов. Несмотря на разработанные протоколы выделения чистых популяций ГСК из взрослого организма, нет методик их культивирования in vitro(в лабораторных условиях). Существующие методы позволяют лишь сохранить или незначительно обогатить популяцию гемопоэтических стволовых клеток. Уже первые попытки их культивирования показали необходимость присутствия фидерного слоя из клеток стромы костного мозга. Как выяснилось позднее, именно клетки стромы костного мозга являются ключевыми регуляторами популяции ГСК. Стромальные элементы определяют пролиферацию и дифференцировку ГСК в костном мозге. Следует отметить, что стромальные клеточные элементы выделяют факторы, определяющие дифференцировку ГСК и миграцию ГСК в костный мозг.  
ГСК способны мигрировать не только в костный мозг, но и из костного мозга в кровоток. Показано, что выход ГСК из костного мозга происходит в ответ на воздействие факторов мобилизации: гранулоцитарно-макрафагального колоние-стимулирующего фактора (ГМ-КСФ), гранулоцитарного колоние-стимулирующего фактора (Г-КСФ). Эти факторы также выделяются клетками стромы. Воздействие ГМ-КСФ и Г-КСФ увеличивает количество ГСК в периферической крови на порядок.  
ГСК могут являться инструментом клеточной терапии при некоторых заболеваниях. Современный уровень развития биотехнологии позволяет исследователям использовать аутологичные ГСК, выделяя их из периферической крови в достаточном количестве. Однако механизмы трансдифференцировки ГСК в настоящий момент изучены недостаточно.  
До последнего времени костный мозг являлся единственным источником гемопоэтических стволовых клеток. После некоторых медицинских процедур и введения в организм так называемых факторов мобилизации (Г-КСФ и ГМ-КСФ) в периферической крови можно увеличить количество ГСК. Нехватка образцов костного мозга заставила исследователей обратить внимание на альтернативные источники стволовых клеток крови. Несомненно, одним из них является пуповинная/плацентарная кровь. В последние годы исследования применимости пуповинной крови шагнули далеко вперед и многие врачи сошлись во мнении, что трансплантация стволовых клеток пуповинной крови может быть альтернативой пересадки костного мозга при онкогематологических и гематологических заболеваниях.  
  Итак, ГСК мультипотентны, могут дифференцироваться в клетки различных органов. При работе с ГСК можно использовать аутологичный материал, и как следствие нет риска отторжения при трансплантации реципиента. Они подвергаются криоконсервации, иными словами существует возможность хранения собственных клеток «про запас» с возможностью их использования через длительное время при сохранении всех свойств и возраста клеток на момент забора. Они не дают опухолей in vivo, при введении в организм не вызывают роста новообразований. На сегодняшний день их нельзя культивировать ex vivo, на настоящий момент не выработаны стабильно воспроизводимые методики увеличения количества гемопоэтических клеток в лабораторных условиях.     
   
СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ НЕРВНОЙ ТКАНИ  
Стволовые клетки нервной ткани (НСК) расположены в специфических областях мозга человека и других млекопитающих.  
Источником стволовых клеток нервной ткани является головной мозг как сформировавшегося, так и развивающегося организма. В результате проведенных экспериментов по трансплантации НСК клетки с донорской меткой были обнаружены в сердце, печени, центральной нервной системе, кишечнике и легких, что доказывает их мультипотентность.  
Несмотря на то, что НСК являются мультипотентными и существует возможность их культивирования in vivo, их применение влечет за собой массу сложностей. Выделение стволовых клеток нервной ткани связано с полным разрушением головного мозга, что делает невозможным применение аутологичного материала, а, как следствие этого, появляются те же проблемы этического и иммунологического характера, что и при использовании фетальных клеток.  
Для клеточной терапии НСК наиболее перспективны при использовании их ортодоксального дифференцировочного потенциала (нейроны и глия). К настоящему моменту разработаны коктейли химических индукторов коммитации НСК к дифференцировке в одном направлении (Bithell and Williams 2005). НСК локализованы в субэпендимном клеточном слое 3 и 4 желудочков головного мозга (Romanko et al., 2004). Таким образом, выделение НСК связано с разрушением головного мозга донора (Rietze et al., 2001). Но при этом возможно использование аллогенного материала для клеточной терапии ЦНС в связи с наличием гематоэнцефалического барьера и отсутствием иммунологических реакций на чужеродный материал, введенный в ЦНС реципиента. Эксперименты с применением фетального материала при терапии болезни Паркинсона к настоящему моменту уже проведены как на экспериментальных животных, так и в клинике (Burnstein et al., 2004).

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ КОЖИ  
Стволовые клетки кожи выделяют из покровных тканей как эмбриона, так и взрослого организма. Клеточную терапию стволовыми клетками кожи связывают прежде всего с восстановлением кожных покровов, например, с восстановлением кожи после обширных ожогов. Сегодня подобные разработки уже применяют в клинике.

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ СКЕЛЕТНОЙ МУСКУЛАТУРЫ  
Стволовые клетки скелетной мускулатуры выделяют из поперечнополосатой мускулатуры. Эти клетки способны к дифференцировке в клетки нервной, хрящевой, жировой и костной тканей, а также, естественно, в клетки поперечнополосатой мускулатуры. Однако последние исследования показывают, что клетки скелетной мускулатуры являются не чем иным, как отдельной популяцией мезенхимных стволовых клеток (см. ниже).

СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ МИОКАРДА   
В 90-х гг. ХХ века из миокарда новорожденных крыс были выделены клеточные элементы, способные к дифференцировке в кардиомиоциты и эндотелий сосудов. Трансплантация таких клеток в область инфаркта миокарда приводит к развитию в зоне повреждения новых кардиомиоцитов и сосудов, в результате чего восстанавливаются функции органа. Однако методика выделения данных клеточных элементов очень сложна и связана с полным разрушением мышечной ткани сердца.

 
МЕЗЕНХИМНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ (МСК)  
Традиционным источником МСК является строма костного мозга. В результате проведенных исследований мезенхимные стволовые клетки были обнаружены также в подкожной жировой ткани, которая в больших количествах остается после пластических операций.  
В настоящее время ведется множество научно-исследовательских работ по выделению достаточного количества МСК из костной ткани и пуповинной крови.  
Мезенхимные стволовые клетки человека рассматривают как один из основных элементов клеточной терапии. Действительно, МСК плюрипотентны и могут дифференцироваться в клетки костной, жировой, мышечной, хрящевой, нервной и прочих тканей. Неоспоримым достоинством работы с МСК служит то, что существует возможность применения аутологичного материала.  

3.Что можно лечить стволовыми клетками?

В настоящее время стволовые  клетки используются при лечении  более 50 смертельно опасных заболеваний, среди них такие как:

• Острые лейкозы  
  Острый лимфобластный лейкоз  
  Острый миелобластный лейкоз  
  Острый бифенотипический лейкоз  
  Острый недифференцированный лейкоз  
  
• Хронические лейкозы  
  Хронический миелоидный лейкоз  
  Хронический лимфоцитарный лейкоз  
  Ювенильный хронический миелоидный лейкоз  
  Ювенильный миеломоноцитарный лейкоз  
  
• Миелодиспластические синдромы  
  Рефрактерная анемия  
  Рефрактерная анемия с кольцевидными сидеробластами  
  Рефрактерная анемия с избытком бластов  
  Рефрактерная анемия с избытком бластов в стадии трансформации  
  Хронический миеломоноцитарный лейкоз  
  
• Болезни, связанные с патологией стволовых клеток  
  Тяжелая форма апластической анемии  
  Анемия Фанкони  
  Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (Болезнь Маркиафавы-Микеле)  
  Парациальная красноклеточная аплазия  
  
• Болезни, связанные с патологией пролиферации миелоидного ростка  
  Острый миелофиброз  
  Идиопатический миелофиброз  
  Истинная полицитемия  
  Эссенциальная тромбоцитемия  
  
• Лимфопролиферативные расстройства  
  Неходжкинская лимфома  
  Лимфома Ходжкина /Лимфогранулематоз  
  
• Фагоцитарные дисфункции  
  Болезнь Чедиака-Хигаши  
  Хроническое грануломатозное заболевание  
  Ретикулярная дизгенезия  
  
• Наследственные нарушения метаболизма  
  Мукополисахароз  
  Болезнь Гарлера  
  Болезнь Шина  
  Болезнь Гюнтера  
  Болезнь Санфилипо  
  Болезнь Моркуи  
  Болезнь Маротсу-Лами  
  Слай-синдром, нарушения бета-глюкуронидазы  
  Адренолейкодистрофия  
  Муколипидоз II  
  Болезнь Краббе  
  Болезнь Гаше  
  Болезнь Нимана-Пика  
  Болезнь Уолмана  
  Метахромная лейкодистрофия  
  
• Гистиоцитарные дисфункции  
  Семейный эритрофагочитарный лимфогистиоцитоз  
  Гистиоцитоз X  
  Гемофагоцитоз  
  
• Наследственные аномалии эритроцитов  
  Тяжелая бета-талассемия  
  Серповидно-клеточная анемия  
  
• Наследственные расстройства иммунной системы  
  Атаксия-телеангиоэктазия  
  Болезнь Костманна  
  Дефицит адгезии лейкоцитов  
  Болезнь Диджорджа  
  Синдром "голых" лимфоцитов  
  Болезнь Оменна  
  Тяжелые смешанные формы иммунодефицита, связанные с:

дефицитом аденозин-деаминазы

отсутствием Т- и В-лимфоцитов

отсутствием Т-лимфоцитов при  нормальном количестве В-лимфоцитов

Болезнь Вискотта-Олдрича  
Лимфопролиферативные расстройства, связанные с Х-хромосомой  

• Другие наследственные расстройства  
  Болезнь Леша-Нихана  
  Гипоплазия хрящей и волос  
  Тромбастения Гланцмана  
  Остеопетрозис  
  
• Наследственная патология тромбоцитов  
  Амегакариоцитоз/ Врожденная тромбоцитопения  
  
• Патологии плазматических клеток  
  Множественная миелома  
  Плазмоклеточный лейкоз  
  Макроглобулинемия Вальденстрема  
  
• Другие онкозаболевания  
  Рак молочной железы  
  Саркома Юинга  
  Нейробластома  
  Рак почки (опухоль Вилмса, гипернефрома)

Стволовые клетки и рак 

В борьбе с раком человечество провело уже не одно десятилетие, но до сих пор самым эффективным  методом считалась радио- или  химиотерапия. Цитостатики, действительно, уничтожают раковые клетки, однако одновременно ликвидируются и клетки костного мозга.             

Чтобы восполнить стволовые  клетки при раке, сейчас используется революционный путь: технологию трансплантации заранее заготовленных или донорских  стволовых клеток. Они способствуют возобновлению и поддержанию  кроветворной функции организма. Забор  клеток должен проводиться до начала курса химиотерапии.

Достаточно часто представляется невозможным заранее заготовить собственные стволовые клетки: рак  уже спровоцировал рост количества злокачественных образований. В  этом случае допускается использование  донорских клеток, однако процент  успеха будет ниже. Тем не менее, иногда такой вариант становится единственным шансом для больного. В качестве донора лучше выбирать ближайших родственников.

В настоящее время использование  стволовых клеток в лечение рака успешно проводится для таких  форм болезни, как лейкемия и миелома. Исследования продолжаются и, возможно, в скором времени человечество победит  смертельно опасное заболевание.

Стволовые клетки и диабет

До недавнего времени  практически единственным методом  терапии для больных диабетом было регулярное введение инсулина. Сейчас, когда появились клеточные регенеративные технологии, тысячи людей получили шанс вернуться к полноценной  жизни без ежедневных инъекций.

Результаты международных  исследований в области клеточной  терапии показали, что стволовые  клетки лечат диабет 1 типа, позволяя больным снизить объем сахаропонижающих лекарств или даже совсем отказаться от них.

Успешное применение стволовых  клеток для лечения диабета основывается на том, что устраняются не симптомы, а причина болезни. Главная задача – восстановление способности поджелудочной  железы самостоятельно вырабатывать инсулин.

Стволовые клетки костного мозга трансплантируются в поджелудочную  железу, после чего преобразуются  в группу бета-клеток. Именно они продуцируют инсулин. Как правило, у больного диабетом 1 типа разрушено около 70% бета-клеток. Логично предположить, что с такими показателями организм уже не способен вырабатывать достаточный объем инсулина. Благодаря терапии стволовыми клетками диабет может быть вылечен настолько эффективно, что ежедневные инъекции больше не понадобятся.

4.Технология обработки пуповинной крови

Пуповинная кровь может помочь в лечении самых разнообразных  заболеваний, главным образом онкогематологических (рака крови), ее донору, а также его ближайшим родственникам – братьям, сестрам и родителям. Клетки, содержащиеся в пуповинной крови, менее иммунореактивны, чем клетки костного мозга. Это означает, что пуповинная кровь может быть трансплантирована реципиенту и при отсутствии полной HLA-совместимости.

Пуповинная кровь по общепризнанному  мнению специалистов – уникальный источник гемопоэтических (кроветворных) стволовых клеток (ГСК). Эти клетки применяются в одном из эффективнейших методов терапии различных форм онкологических, гематологических и  аутоиммунных заболеваний у взрослых и детей - трансплантации гемопоэтических cтволовых клеток (ТГСК).   
 Первое применение стволовых клеток пуповинной крови в качестве альтернативы трансплантации костного мозга произошло в 1988 году в Париже, когда ребенку с анемией Фанкони была произведена трансплантация стволовых клеток, собранных и выделенных из пуповинной крови его сестры.  С этого момента по всему миру - сначала в США и Европе, а затем и в России, начали создаваться банки пуповинной крови и проводиться сотни исследований терапии стволовыми клетками пуповинной крови.  
 Банк пуповинной крови - это криогенное хранилище, где в специальных контейнерах с индивидуальной маркировкой хранятся стволовые клетки (СК) при постоянной температуре -196˚С (в парах жидкого азота). Таким образом, существует возможность в любой момент прийти в банк пуповинной крови и получить готовые к употреблению СК для проведения лечения.  

Банк стволовых клеток человека – это система специализированных учреждений, основной задачей которых является подготовка образца к криоконсервации и длительное, практически не ограниченное во времени хранение ранее заготовленных стволовых клеток, вне зависимости от источника их получения. Существуют две системы банков стволовых клеток: банки персонального хранения и донорские банки. В банках стволовых клеток персонального хранения находятся клетки для конкретных реципиентов, в донорских банках стволовые клетки хранятся для аллогенных трансплантаций.

Банкирование пуповинной крови - это комплекс мероприятий по забору, обработке и долговременному хранению пуповинной крови новорожденного. Наилучшие условия для хранения создаются при температуре жидкого азота, минус 196 градусов Цельсия. В этих условиях стволовые клетки могут храниться десятилетиями. В последующие годы они могут быть извлечены из криогенного хранилища, разморожены и использованы в лечении различных заболеваний, главным образом – онкогематологических (рака крови).

Сбор пуповинной крови - абсолютно  безопасная и быстрая процедура, поскольку в ходе нее не происходит физического контакта с матерью  и ребенком. До момента помещения  концентрата стволовых клеток пуповинной крови на постоянное криогенное хранение осуществляется следующая технологическая  цепочка:  
 
1.Забор пуповинной/плацентарной крови;  
2.Тестирование и типирование крови;  
3.Выделение стволовых клеток;  
4.Расфасовка и маркировка стволовых клеток;  
5.Карантинное хранение;  
6.Хранение концентрата стволовых клеток пуповинной крови.